K.骨骼肌提取物對肌紅蛋白的還原作用

原則

肌紅蛋白還原酶活性通過監(jiān)測MMb還原為DMb的過程來測定，隨后在有氧體系中快速生成OMb。

酶活性的計算依據(jù)是反應(yīng)初始線性階段（1至2分鐘）期間OMb在580 nm波長處吸光度的增加。

操作步驟

1. 取5克（稱重至0.1克）不含可見脂肪或結(jié)締組織的肌肉組織樣本，將其切成小塊。

2. 將樣品在20 mL的0.2 mM磷酸鈉緩沖液（pH 5.6）中均質(zhì)化（或肌肉的pH值)持續(xù)90秒，或持續(xù)作用，直至肌肉組織結(jié)構(gòu)消失。

3. 在 4°C 下使用Beckman超速離心機(jī)以35,000× g 離心30分鐘。

4. 將上清液倒入小燒杯中，用0.4微米注射器濾器過濾2-3 mL，轉(zhuǎn)移至小試管中。

5. 配制試驗溶液：

5 mM EDTA二鈉

50 mM檸檬酸鈉緩沖液pH 5.65（將此pH調(diào)整至所需pH）

3.0 mM Potassium Ferricyanide

0.75 mM甲基肌紅蛋白（馬骨骼肌來源，貨號Sigma M-0630，或經(jīng)純化處理的豬/牛來源，

詳見純化方案）溶于30 mM磷酸鈉緩沖液

1.0 mM NADH（Sigma N-8129）

6. 打開日立UV-2010分光光度計并預(yù)熱10分鐘。

7. 如果可能，加載一個分光光度法軟件程序，該程序可在180至240秒內(nèi)測量580nm處的吸光度增加；否則手動加載軟件.

8. 將空比色皿放入分光光度計比色皿中，并將儀器歸零。

9. 向塑料微孔板中加入以下試劑量：

100 µL 5 mM EDTA 

100 µL 50 mM檸檬酸鹽緩沖液

100 µL 3.0 mM Potassium Ferricyanide

200 0.75 mM甲基肌紅蛋白的 µL 值

200 µL 去離子水

10. 將每個微量比色皿放入分光光度計比色皿中，同時加入

100 1 mM NADH的 µL 值

200 µL 過濾后的肌肉提取物

11. 用移液管充分混勻，然后至少釋放兩次溶液。

注意：加入試劑并盡快混合，因為反應(yīng)會立即開始。

12. 盡快開始在580nm處測量吸光度增加，并持續(xù)進(jìn)行180至240秒。隨著肌紅蛋白被肌肉提取物還原，吸光度在580nm會增加。

14. 肌紅蛋白還原酶活性的表達(dá)方式為：在時間進(jìn)程的初始線性階段（通常為前段或前兩分鐘），每分鐘每克肌肉中還原的肌紅蛋白納摩爾數(shù)。

樣例

如果0秒時580nm處的吸光度為0,60秒時吸光度為0.132，則ΔAbs580nm=0.132/分鐘。使用比爾定律計算甲基肌紅蛋白到氧合肌紅蛋白的濃度變化。

A = Ebc，其中

A=吸光度（或吸光度變化）

b=路徑長度（塑料微孔板為1 cm）

E=消光系數(shù)（12000）C = 濃度mol/L） / 升 0.132=12000×1×c 

c = 0.132/12000 

c = 11.0 × e-6 M/分鐘/5克肌肉或11 µM /分鐘/5克肌肉

記下

記住，這里說的是濃度變化，而不是濃度本身。將濃度變化乘以比色皿中的體積，即可將濃度換算為摩爾。

11 e-6 mol/L/分鐘/5克 × 0.0015升 = 

16.5×10^-9摩爾/分鐘/5克肌肉= 

16.5 nmol每分鐘/5克肌肉= 

3.3 nmol/分鐘/克肌肉

每分鐘每克肌紅蛋白的還原量為3.3 nmol，即為報告數(shù)值

記下

如果將吸光度的變化取120秒（2分鐘）的平均值，然后將最終數(shù)值除以2 。

參考文獻(xiàn)

Hagler，L.，R. I. Coppes Jr.，和 R. H. Herman. 1979 . 甲基肌紅蛋白還原酶. J. Biol. Chem. 254：6505—6514. 

Madhavi，D. L.和C. E. Carpenter. 1993 .衰老和加工影響牛肉肌肉的顏色、高鐵肌紅蛋白還原酶和耗氧量。J. Food Sci. 58： 939 -942。

Mohan，A.，M. C. Hunt，T. J. Barstow，T. A. Houser和D. M. Hueber. 2010a. 通過近紅外血氧測定法檢測三種

后強直期骨骼肌中肌紅蛋白的氧化還原形態(tài)。Food Chem. 123 ：456—464。

L.檢測變性血紅蛋白血色素的反射率

原則

變性珠蛋白血紅素色素的存在可通過528和558納米處的反射峰來判斷（Ghorpade和Cornforth，1993）。

材料和設(shè)備

1. 白色標(biāo)準(zhǔn)品（硫酸鋇粉末）

2. 配備樣品和標(biāo)準(zhǔn)品接口的記錄型分光光度計及積分球附件。

3. 透明聚乙烯真空袋（1.5 mil厚度）。

操作步驟

1. 使用白色標(biāo)準(zhǔn)品（粉狀硫酸鋇）在樣品和標(biāo)準(zhǔn)端口的反射附件中，將記錄分光光度計的反射率從420至700nm標(biāo)準(zhǔn)化為100%。

2. 獲得3 cm × 3 cm的均勻肉片（覆蓋反射附件上的樣品端口，確保無任何暴露區(qū)域），厚度>3 mm。

3. 為排除空氣和減少褪色，將新鮮切片迅速放入透明聚乙烯真空袋（厚度1.5mil）中。從底部向上壓緊袋子以消除氣泡。測量反射率時，樣品仍留在透明聚乙烯袋中。

4. 將裝袋樣品緊密放入反射率球的樣品口，使新鮮切片的表面朝內(nèi)（即朝向檢測器）。記錄420至700納米波長范圍內(nèi)的表面反射率（以標(biāo)準(zhǔn)值百分比表示）。變性珠蛋白血紅素色素的存在可通過528和558納米附近出現(xiàn)反射率峰值來判斷（戈爾帕德和康福斯，1986；康福斯，2001）。

5. 可選：若需獲取新鮮樣本與褪色樣本的差異光譜，可將 對照組肉片置于空氣中褪色15至30分鐘 。

6. 將樣品裝入袋中，按新鮮樣品的描述記錄反射光譜。

7. 從新鮮樣本光譜中減去基線光譜（褪色切片）。

參考文獻(xiàn)

Cornforth，D. P. 2001. 熟肉與腌制肉色素的分光光度法及反射率測定。收錄于《食品分析化學(xué)新實驗指南》F3.2單元，由S. J. Schwartz主編，John Wiley and Sons Inc.出版社，紐約。

Ghorpade，V.M.和D.P.Cornforth.1993.在65°C或82°C下烹制的豬肉烤制過程中產(chǎn)生粉紅色的色素的光譜。J.Food Sci. 58：51-52,59。

M. nitrite熟肉分析

原則

亞硝酸鹽離子被溶入熱水中。取部分提取液與格里斯試劑（硫酰胺+N-（1-萘基）乙二胺）混合，生成峰值吸光度為540 nm的粉紅色偶氮染料。粉紅色調(diào)的深淺與初始亞硝酸鹽濃度（按比爾定律）成正比。樣品亞硝酸鹽濃度通過亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，并考慮樣品稀釋倍數(shù)。

試劑和儀器

1. NED試劑：將0.2 g N -（1-萘基）乙二胺-2-HCl溶于150 mL 15%（v/v）乙酸中，必要時過濾，儲存在棕色玻璃瓶中。

2. 磺胺試劑：取0.5克磺胺溶于150毫升15%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸中，必要時過濾，置于棕色玻璃瓶中保存。

3. 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)：

a. 貯備液：亞硝酸鈉1000ppm。取亞硝酸鈉1.0g溶于水，稀釋至1L。

b. 中間溶液：100 ppm亞硝酸鈉。取100 mL原液，加水稀釋至1 L。

c. 工作溶液：1 ppm亞硝酸鈉。取10 mL中間體溶液，用水稀釋至1 L。

4. 取3-4張濾紙，分析盒中濾紙的亞硝酸鹽污染情況。通過每張濾紙過濾約40mL水。加入4mL磺胺類試劑， 攪拌，靜置5分鐘，加入4毫升NED試劑，混合后靜置15分鐘。若檢測到陽性結(jié)果，請丟棄整盒。

操作步驟

1. 稱取5克細(xì)碎組織，將樣本充分混勻后置于50毫升燒杯中。

2. 加入約40mL80℃水，用玻璃棒充分混勻，破碎所有塊狀物， 并轉(zhuǎn)移至500 - mL容量瓶中。

3. 用熱水分次清洗燒杯和棒，將所有洗液倒入燒瓶中。

4. 加入足量熱水，使體積達(dá)到約300mL，將燒瓶轉(zhuǎn)移至80°C 水浴中， 并靜置2小時 ，偶爾搖動 。

5. 冷卻至室溫，用水稀釋至體積，并再次混合。

6. 過濾，向 50 - 50 mL容量瓶 中含5至50 µ g亞硝酸鈉的等分試樣中加入2.5 mL磺胺類試劑， 并混合 。

7. 5分鐘后，加入2.5 mL NED試劑，混合，稀釋至體積，再次混合， 15分鐘內(nèi)顯色 。

8. 將溶液轉(zhuǎn)移至分光光度計比色皿中，以含45mL水、2.5mL磺胺類試劑和2.5mLNED試劑的空白溶液為對照，測定540nm處的吸光度。

9. 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：向50毫升容量瓶中分別加入10、20、30和40毫升工作硝酸鈉溶液，加入2.5毫升磺胺類試劑，混勻后按上述步驟進(jìn)行，從步驟7開始。最終溶液中硝酸鈉濃度為1 ppm時，標(biāo)準(zhǔn)曲線呈直線。

計算

樣品中NaNO的ppm2（µg NaNO2/g樣品）=標(biāo)準(zhǔn)曲線給出的ppm NaNO2×50/分裝量（mL）×500/樣品重量(g) 

參考

AOAC.1990.《熟肉中亞硝酸鹽的測定方法973.31》，載于《標(biāo)準(zhǔn)分析方法》第15版，K.Helrich主編，弗吉尼亞州阿靈頓：AOAC出版社，第938頁。

n. 烤肉及配料的硝酸鹽分析

原則

亞硝酸鹽和硝酸鹽離子需用熱水提取。初始亞硝酸鹽濃度通過與格里斯試劑反應(yīng)后產(chǎn)生的粉紅色（540nm波長）強度測定，具體方法如先前所述。測定硝酸鹽+亞硝酸鹽時，將樣品提取液與釩（III）溶液+格里斯試劑混合孵育。酸性溶液中的釩可將所有硝酸鹽離子還原為亞硝酸鹽。隨著亞硝酸鹽生成，其會與預(yù)先存在的亞硝酸鹽一同被格里斯試劑捕獲。硝酸鹽

濃度=總亞硝酸鹽（釩測定法中硝酸鹽+亞硝酸鹽的總和）-初始亞硝酸鹽。該方法經(jīng)過改良，將釩+格里斯試劑合并為單一溶液，并改用分光光度計比色皿進(jìn)行檢測。

程序（NEMI ，2011）

1. 將約200 mL 0.5 M鹽酸倒入一個小瓶中。

2. 將瓶子置于帶通風(fēng)罩的天平上，直接稱取約0.5 g三氯化釩（III）放入瓶中（為避免其粘附在鏟子、稱量器等上）。如果 仍有未溶解的顆粒殘留 ， 通過 > 2微米注射器過濾器 進(jìn)行過濾。

3. 加入約0 . 2g磺胺和0 . 01g N -（1-萘基）C?H??Cl?N? 或 (CH?NH?·HCl)?（NED）并溶解。

記下

將打開的VCl瓶 3 放置在無水硫酸鈣等干燥劑上。VCl在潮濕空氣中會 3 釋放腐蝕性氣體，但在試劑中溶解后 將不再釋放氣體。 氯化釩不被歸類為有毒或?qū)Νh(huán)境有害（MSDS 數(shù)據(jù)），與舊方法中使用的鎘不同。

VCl 3 + Greiss試劑溶液冷藏可保存約一周，但對空氣和光線敏感，若在室溫下放置數(shù)日且未加蓋，易被氧化。

將以下體積的樣品和試劑直接混合在半微量比色皿中，或按所用儀器的細(xì)胞大小進(jìn)行比例調(diào)整。

對于1至20ppm（µg /mL）硝酸鹽氮，將20 µ L樣品與1000 µL 試劑混合。

對于1至10ppm硝酸鹽氮，使用45 µL 樣品和1000 µL 試劑。

當(dāng)硝酸鹽氮含量低于1ppm時，使用500µL樣品和500µL試劑（注：1,000µL=1mL）。（如果新批次樣品的濃度未經(jīng)標(biāo)定，可通過篩選幾個代表性樣品快速估計其濃度范圍。將等量樣品與試劑混合。對幾個標(biāo)準(zhǔn)品也做同樣的處理 。在烘箱或熱水下對樣品進(jìn)行短暫加熱 ?；陬伾容^，判斷出有效的濃度范圍。）

將樣品移入半微量比色皿，隨后向所有比色皿中加入試劑。蓋上蓋子，輕輕倒置以充分混合。樣品需在室溫（20-25℃）條件下保存。顯色反應(yīng)在4-5小時后逐漸減弱，6-10小時后達(dá)到峰值。比色測定需以試劑空白（水）為對照，在540nm波長下進(jìn)行。建議將標(biāo)準(zhǔn)品與樣品共同分析，以便建立校準(zhǔn)曲線用于濃度計算。雖然4-5小時后即可進(jìn)行測量，但為確保準(zhǔn)確性，建議次日制備樣品并測定吸光度。顏色可能可在60 ℃下約2小時內(nèi)顯色，或?qū)悠坊旌嫌谛≡嚬苤?，在約100℃下加熱10至15分鐘，確保顏色充分顯色。

肉類樣品的制備采用與亞硝酸鹽測定相同的熱水萃取法。計算硝酸鹽/亞硝酸鹽濃度時，需考慮樣品的稀釋倍數(shù)。

該方法經(jīng)過輕微調(diào)整，具體說明可參見 NEMI （NEMI ，2011）。

參考文獻(xiàn)

多恩，T. A.和W. R. Horwath. 2003 .用單一試劑測定硝酸鹽的分光光度法。分析。Lett .36：2713—2722。

NEMI（國家環(huán)境方法索引）。2011。國家環(huán)境方法索引。2011。 h**ps:// ***.nemi.gov/ 。

o. t BARS氧化酸敗檢測法——快速濕法

原則

在Thiobarbituric Acid（TBA）存在下，丙二醛和脂質(zhì)氧化的其他醛類產(chǎn)物（TBA反應(yīng)物質(zhì)；TBARS）會形成粉色顯色劑，其主吸收峰位于532至535 nm。然而，在干擾性糖類存在時，會形成黃色顯色劑，采用Tarladgis（1960）蒸餾法可避免此現(xiàn)象。

試劑

1. TBA貯備液：0.375%Thiobarbituric Acid、15%Trichloroacetic acid和0.25N鹽酸 。

2. 100mL貯備液足以進(jìn)行20次單獨檢測。 貯備液可在室溫下避光保存（封裝于鋁箔包裝容器中）。

操作步驟

1. 將目標(biāo)產(chǎn)物切碎或絞碎，稱取兩份0.5克樣品。

2. 向每個樣品中加入2.5 mL TBA貯備液，使稀釋倍數(shù)為6?；靹颉?/p>

3. 將樣品置于沸水中加熱10分鐘，使用松蓋試管（圓底Pyrex 或聚丙烯離心管）。 注意： 密封蓋試管在加熱過程中可能爆裂。加熱過程中陽性樣品會變成粉色。

4. 用自來水冷卻試管。

5. 在4 °C 下以5000× g 離心10分鐘，獲得澄清上清液。

6. 小心地將上清液的一部分移至分光光度計比色皿中，注意溶液保持澄清。

7. 在532 nm處測定上清液吸光度，空白對照為含有所有試劑，但不含肉的溶液。

8. 使用粉色TBA顯色劑的消光系數(shù) 1.56×10^5 56×10^5 56 / M / cm（Sinnhuber和Yu，1958），計算以ppm丙二醛表示的TBA值具體方法如下 ：

TBARS 數(shù)值（mg MDA/kg） = 樣品 A 532 ×（1M TBA顯色劑 / 156 ，000）× [（1mol /L/M]×（0.003L/0.5g 肉）×（72.07gMDA/mol MDA）×1000mg/g）×1000g/kg)，或TBARS 值（ppm）= 樣品A A 532 ×2.77 。

參考文獻(xiàn)

Buege，J. A.和S. D. Aust. 1978 .微粒體脂質(zhì)過氧化.方法酶學(xué).52： 302 — 304 . 

Sinnhuber，R. O.和T. C. Yu .1958. 2 - 魚類制品酸敗度的Thiobarbituric Acid法測定 .II.丙二醛的定量測定.食品技術(shù).12：9—12.

P.t BARS氧化酸敗檢測法——蒸餾法

原則

該方法中，將樣品置于水中加熱，通過蒸汽蒸餾收集揮發(fā)性丙二醛及其他TBA反應(yīng)物質(zhì)（TBARS）。向 蒸餾液等分試樣中加入TBA溶液，形成粉紅色TBA顯色劑 ， 通過分光光度法進(jìn)行定量（Tarladgis等人 ， 1960 ； Koniecko ， 1979）。

解決方案

1. TBA試劑：將1.44g2-Thiobarbituric Acid（分子量144.1）溶于450mL冰醋酸中。用50-mL容量瓶定容。攪拌后，置于暗處（用鋁箔包裝）保存。

2. 磺胺試劑：將1克磺胺溶解于含有40毫升濃鹽酸和160毫升蒸餾水的溶液中。

操作步驟

1. 將10克絞碎或切碎的肉樣與50毫升蒸餾水混合，使用Waring攪拌器。定量轉(zhuǎn)移至圓底加熱瓶（凱氏瓶），并添加47.5毫升額外水。加入2.5毫升6 N鹽酸溶液（1,2濃縮鹽酸與水混合）。

2. 為防止碰撞，可添加若干玻璃珠。若加熱時起泡，可加入消泡劑（如陶氏H-10消泡劑或同類產(chǎn)品）。

3. 將燒瓶充分加熱以產(chǎn)生蒸汽 。 使用水 冷凝蒸餾裝置 ，將50mL蒸餾液收集到量筒中。每份樣品所需時間約為10分鐘。

4. 將蒸餾液充分混勻，用移液管吸取5mL注入50mL帶塞玻璃瓶中，加入5mLTBA 試劑 。

5. 與 由5mL蒸餾水和5mLTBA試劑組成的空白 混合后，將其與空白一起浸入沸水浴中，精確浸泡35分鐘。

6. 將冷卻后的樣品瓶置于自來水下靜置10分鐘。使用零點校準(zhǔn)的分光光度計，在538nm處測定吸光度，以TBA-水空白為對照。

參考文獻(xiàn)

Koniecko，E. S. 1979. 《肉類化學(xué)家手冊》，第53、54和62頁。Avery Publ. Group Inc.，Wayne，NJ。

塞弗特 ，M .，M . C . 亨特 ，J . P . 格羅貝爾 ，S . M . 瑞安 ，D . E . Johnson ，和 R . A . 莫德倫 . 2006 . 乳酸鉀和新鮮豬肉香腸配方對有光和無光展示貨架壽命的影響。J. Food Sci. 71：C390 – C394. 

塔拉德吉斯、B. G.、B. M. 沃茨和M. T. 尤納森，1960年?！队糜诙繙y定變質(zhì)食品中丙二醛的蒸餾法》，載于《美國油脂化學(xué)學(xué)會雜志》第37卷第44–48頁。