肉類顏色測量指南

肌紅蛋白和肉色的研究

本指南中的大部分章節(jié)涉及視覺或分光光度分析。本節(jié)將重點介紹實驗室分析，例如肌肉pH和肌紅蛋白濃度，這些分析有助于表征骨骼肌中的顏色化學(xué)?？赡苄枰~外閱讀文獻(xiàn)以正確應(yīng)用和解釋這些程序的數(shù)據(jù)。肌紅蛋白化學(xué)在第二節(jié)中進(jìn)行了總結(jié)，但許多其他肉類顏色和肌紅蛋白化學(xué)的綜述及書籍章節(jié)也有助于加深對這些程序的理解。本節(jié)描述了各種實驗室檢測和測量的程序，并隨后列出一個或多個推薦的分析方案。

A. 新鮮肉類研究

1. pH。 肉類pH可能是影響新鮮和熟肉顏色的最重要單一因素。因此，肉類顏色研究中應(yīng)報告pH值。當(dāng)pH從5.6增加到8.5時，肌紅蛋白氧化（及褐變）顯著受到抑制（Shikama和Sugawara，1978；Yin和Faustman，1993）。肉色素的溶解度也受到肉pH的顯著影響。因此，提取溶液被緩沖至pH6.8，以從肉樣中獲得肌紅蛋白和血紅蛋白高產(chǎn)量（Warriss ， 1979）。 

此外 ，在制備純化肌紅蛋白時，離心和透析步驟中使用pH8.0至8.5的緩沖溶液，以最小化肌紅蛋白氧化（Faustman和Phillips，2001）。烹飪過程中肌紅蛋白的變性在pH>6.0時也顯著降低（Trout，1989），這解釋了由高pH、深色切割牛肉制成的熟牛肉餅持續(xù)粉紅的現(xiàn)象（Moiseev和Cornforth，1999）。相反，當(dāng)pH降至5.5–5.7、牛肉餅在烹飪過程中過早變褐會增加，因為較低的pH有利于MMb的形成（Hunt等人，1999）。

第XI-A節(jié)推薦用于測量預(yù)僵化肉的pH值，使用碘乙酸抑制糖酵解并防止乳酸進(jìn)一步產(chǎn)生。第XI-B節(jié)推薦用于后僵化肌肉或熟肉制品。越來越多的研究人員還使用配備穿透性pH探頭的便攜式儀器測量單個肌肉的pH值。與所有pH測量一樣，該設(shè)備必須根據(jù)制造商的說明進(jìn)行校準(zhǔn)，使用標(biāo)準(zhǔn)溶液。感興趣的pH范圍（通常為4.0至7.0）。校準(zhǔn)溶液應(yīng)處于或接近 實際樣品溫度 。

2. 新鮮肉類中的總色素含量。 肉類色素含量之所以備受關(guān)注，一方面與肉色深淺密切相關(guān)，另一方面從營養(yǎng)學(xué)角度看，它能反映血紅素鐵的含量。肉類是重要的鐵質(zhì)來源，但不同形態(tài)的鐵元素在生物利用率和引發(fā)氧化反應(yīng)的潛力上存在差異。因此，準(zhǔn)確測定肉類中血紅素鐵與非血紅素鐵的含量可能具有重要價值（卡彭特 和克拉克，1995）。

染料提取和分光光度法（透射或吸收）是測定總肌紅蛋白和血紅蛋白濃度的優(yōu)選方法。第十一節(jié)-C描述了一種在pH 6.8的冷磷酸鹽緩沖液中提取肉類色素的方法（Warriss，1979）。 通過添加亞硫酸氫鈉將所有色素轉(zhuǎn)化為還原、去氧形式（Hunt等人，1999）。色素濃度通過去氧色素在433 nm（Soret峰）處的吸光度測定。第十一節(jié)-D描述了一種類似的在冷磷酸鹽緩沖液中提取肉類色素的方法，但總色素濃度通過525 nm處的吸光度測定，這是三種肌紅蛋白形式的等峰點。第十一節(jié)-D基于 Krzywicki（1979）的方法，經(jīng) Trout（1989）修改，并由Tang、Faustman和Hoagland（2004）進(jìn)一步改進(jìn)。

為測量肉表面肌紅蛋白形式的相對比例，推薦Tang等人（2004）的更新方法。然而，對于溶液中總色素濃度的測定，兩種方法可得出等效結(jié)果。Trout（1989）和Tang等人（2004）的總Mb公式僅在Mb 分子量 的數(shù)值上略有不同。

可溶性肉色素總量也可采用Drabkin（1950）的經(jīng)典方法進(jìn)行測定 。色素提取方法如先前所述（Warriss，1979），使用pH 6.8的0.04 M磷酸鹽緩沖液以MAX限度提取正常pH肉中的色素，或使用pH低于6.8的緩沖液以防止高pH肉產(chǎn)生渾濁的色素提取物（de Duve，1948；Hunt和Hedrick，1977）。 隨后向部分提取液中加入K?[Fe(CN)?]和Potassium Cyanide，將色素轉(zhuǎn)化為氰化高鐵肌紅蛋白形式 。

通過分光光度法可測定肌紅蛋白濃度 ，使用氰化高鐵肌紅蛋白在540 nm處的吸收系數(shù) 11.3mM?1 cm?1 及肌紅蛋白分子量17,000（Drabkin，1950）。所有肉類（新鮮、熟食、或腌制）的總血紅素色素含量 可通過將血紅素組分提取到酸化丙酮中形成血紅素（氯化鐵原卟啉；Hornsey，1956），如第XI-E和XI-F節(jié)所述。

卡爾松和倫德斯特倫（1991）采用溫和試劑（*和Triton X-100）提取血紅素，最終獲得堿性血紅素（鐵原卟啉氫氧化物）。

根據(jù)樣本在575 nm處的吸光度，與堿性血紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，測定肌紅蛋白濃度。

3. 分離肌紅蛋白與血紅蛋白。骨骼肌的粗提物常被用于肌紅蛋白研究，但為減少其他可溶性肌漿蛋白和酶的影響，通常需要使用100%純度的肌紅蛋白。

在第XI-G節(jié)中，福斯特曼和菲利普斯（2001年）詳細(xì)描述了一種通過硫酸銨沉淀法從肌肉組織中提取血紅素色素的方法，并采用凝膠過濾層析法將肌紅蛋白與血紅蛋白分離。該方法適用于從多種動物物種中純化肌紅蛋白，僅需少量硫酸銨沉淀初始水平的改變。 可通過測定純化組分的蛋白質(zhì)含量 ，并考慮初始樣品重量和稀釋因子來測定肌紅蛋白和血紅蛋白濃度。

高壓液相色譜法（HPLC）還可用于定量分析總血紅素色素及肌紅蛋白與血紅蛋白的分配情況（奧林格拉特等 人，1990年）。特勞特和古茲克（1996年）提出了一種 HPLC 方法：通過計算280納米處的色譜峰面積百分比來測定肌紅蛋白占總蛋白的比例，同時通過525納米處的色譜峰面積百分比來確定肌紅蛋白占血紅素蛋白的比例 ，從而實現(xiàn)肌紅蛋白的分離與純度測定。

4. 肌紅蛋白形態(tài)的相對比例 。 肉品表面肌紅蛋白形態(tài)（肌紅蛋白原、肌紅蛋白、肌紅蛋白原結(jié)合態(tài)和肌紅蛋白結(jié)合態(tài)）的相對比例 會顯著影響肉品色澤和零售接受度。例如，當(dāng)零售牛肉產(chǎn)品表面肌紅蛋白原結(jié)合態(tài)比例超過40%時，消費者接受度會大幅下降（格林等人，1971年）。 肉品表面肌紅蛋白形態(tài)的相對比例通過第九節(jié)所述的反射率測量法 進(jìn)行測定。 細(xì)胞勻漿液中肌肉樣本的肌紅蛋白形態(tài)比例則通過其對應(yīng)峰的吸光度進(jìn)行測量（特勞特，1989年；唐等人，2004年）。

提取技術(shù)很少能阻止肌紅蛋白的一種形式轉(zhuǎn)化為另一種形式，也無法提供溶液中氧化還原穩(wěn)定性的可靠信息。Krzywicki（1982）采用特殊的預(yù)防措施和提取條件，以盡量減少MMb的變化；

他在低溫下進(jìn)行萃取，并用緩沖液控制pH值。即便如此，OMb和DMb的比例仍發(fā)生了一些變化。Krzywicki的方程（Krzywicki，1982）被廣泛用于估算 溶液中肌紅蛋白不同氧化還原形式的相對比例。有時，這些方程會為某些氧化還原形式生成負(fù)值 ， 有時通過將三種氧化還原形式的總和獲得的估計值超過100%。這主要是由于在這些方程中選擇了不合適的波長（545、565和572nm）。為了解決這個問題，Tang等人（2004）使用了503 nm的波長MAX值來處理MMb，557 nm用于DMb，582 nm用于OMb（圖10.1）。修訂的方程在處理負(fù)值和總和達(dá)到100%方面表現(xiàn)更好（第IX節(jié)）。

5. 溶液中COMb與OMb的鑒別方法。如圖10.2所示，櫻桃紅色氧化還原態(tài) COMb與OMb的吸光度光譜高度相似。傳統(tǒng)肌紅蛋白氧化還原態(tài)估算公式（Krzywicki，1982；Tang等，2004）未考慮COMb的存在。若用這些公式測定純COMb溶液中棕色色素（MMb）的生成量，會導(dǎo)致負(fù)值等錯誤結(jié)果 ，甚至出現(xiàn)總和超過100%的情況。為此，研究者采用A503/A581比值作為褐變指數(shù)，該指標(biāo)可間接反映MMb的生成量（Suman等，2006）。通過 分裂比色皿中COMb 、 OMb 與MMb的組合實驗 ，驗證了該褐變指數(shù)的有效性。

Nam和Ahn（2002年）研究發(fā)現(xiàn)，有氧包裝火雞胸肉滴液中的OMb（Oxidized Methylbenzene）在541和576納米處呈現(xiàn) β 和 α 特征峰，經(jīng)輻照處理后，這些特征峰分別向短波長方向移動至536和566納米。研究人員還通過反射光譜技術(shù)區(qū)分了OMb與COMb。氣相色譜分析證實輻照樣品中產(chǎn)生了CO。

因此，COMb是輻照火雞胸肌中粉紅色色素的來源（Nam和 Ahn，2002）。馬OMb的 β 和 α 峰分別位于544和582納米處（Bowen，1949），而COMb的峰則略微向短波長方向偏移（540或541納米和577納米）（Bowen，1949；S?rheim等人，2006）。雖然理論上可以基于400至700nm的特征光譜區(qū)分COMB和OMb，但目前 無法確定暴露于一氧化碳和二氧化氧的肉樣中它們的相對比例 。

6. 線粒體耗氧量。 線粒體活性在死后肌肉耗氧量中起著重要作用，影響肌紅蛋白氧合速率和顏色穩(wěn)定性。隨著肌肉死后年齡的增加，線粒體活性有下降趨勢。高儲存溫度和高pH值會顯著影響死后線粒體活性（Cheah和Cheah，1971；Ashmore等人，1972；Bendall和Taylor，1972；Cornforth和Egbert ，1985）。 肉類消耗的氧氣會影響肌紅蛋白氧合因為線粒體酶和肌紅蛋白之間存在對可用氧氣的競爭。隨著死后線粒體活性的下降，肌紅蛋白氧合速率更高。在肉類中，許多細(xì)胞過程和細(xì)胞器對可用氧氣的競爭會影響肌紅蛋白的氧化還原穩(wěn)定性和MMb 的減少（Ramanathan等人 ， 2009）。第XI節(jié) - H描述了分離線粒體的方法 ，第XI-I節(jié)描述了測量線粒體耗氧率的方法。

此外，骨骼肌的線粒體含量因生理來源不同而存在差異，導(dǎo)致相對耗氧率（OCR）、 肌紅蛋白氧化還原形態(tài) 在表層與深層的分布，以及肉色穩(wěn)定性等方面存在差異。新鮮肉類在儲存和展示過程中保持“鮮紅"狀態(tài)的能力也存在差異。

肌肉（阿特金森和福萊特，1973；胡德，1980；奧基夫和胡德，1982；雷內(nèi)爾和拉巴斯，1987；曼奇尼和亨特，2005）研究表明，線粒體含量較高的肌肉通常具有更高的氧化鈣釋放率（OCR），并能形成更多線粒體膜結(jié)合蛋白（MMb）。同樣地，色素流失較快的肌肉往往顏色穩(wěn)定性較差且OCR值較高（奧基夫和胡德 ，1982；雷內(nèi)爾和拉巴斯，1987）。阿特金森和福萊特（1973）還指出，骨骼肌OCR值與色素流失速率呈正相關(guān)——OCR值越高，色素流失速率越快。通過測量OCR值，可以評估不同生理來源的尸體骨骼肌線粒體活性及其相對顏色穩(wěn)定性。

肉類科學(xué)家已開發(fā)出多種客觀檢測方法來測定肌肉耗氧量和氧化偶聯(lián)反應(yīng)（OCR），包括瓦爾堡燒瓶法（Urbin和Wilson，1961）、差示呼吸測定法（DeVore和Solberg，1975）、克拉克氧電極法（Lanari和Cassens，1991；Ramanathan等，2009）、反射光譜法（Madhavi和Carpenter，1993）以及頂空氧分析儀（Sammel等，2002）。光線與肉類色素的相互作用為利用近紅外（NIR ；700-1000納米）技術(shù)檢測肌紅蛋白（Mb）的氧化還原動態(tài)提供了新思路。近期，Mohan團(tuán)隊（2010a）采用頻域多距離（FDMD）NIR組織血氧儀，實現(xiàn)了對骨骼肌中肌紅蛋白氧飽和度和OCR的實時、Non-Invasive、直接測量。

7. 降肌紅蛋白活性（MRA）。測定MMb所用的方法學(xué)

不同研究者對肉類活性降低（MRA）的評估存在顯著差異（參見綜述文章）（Bekhit和Faustman，2005）。測定 MRA常用的方法是首先誘導(dǎo)MMb的初始水平較高（通常通過在1%O大氣或亞硝酸鹽誘導(dǎo)氧化包裝），隨后進(jìn)行促進(jìn)MMb還原的檢測步驟。通過分析肌肉中總MMb含量在還原步驟中的變化，可評估肌肉的還原能力。然而，肉類顏色研究者常質(zhì)疑MMb含量變化呈現(xiàn)與解讀的方法是否可靠。

曼奇尼等人（2008年）研究了展示后 MRA 值在表層與深層區(qū)域的差異，并比較了包裝氧濃度對這些區(qū)域差異及 MRA值的影響。他們還考察了還原甲基甲基溴（MMb）的四個測量指標(biāo)——初始MMb形成量（IMF）、還原后MMb量（PRM）、Reduction amount?還原量與相對還原量 ——與顏色穩(wěn)定性之間的關(guān)聯(lián)。研究發(fā)現(xiàn)，這四個MMb/ MRA測量指標(biāo)與可見表層顏色穩(wěn)定性數(shù)據(jù)呈現(xiàn)正相關(guān)。研究者指出，不論是表層肌肉 還是 深層還原活性測量值，均未與表層顏色穩(wěn)定性存在相關(guān)性。

他們發(fā)現(xiàn)，在他們的研究中使用的所有肌肉中，在牛排表面測量的傳統(tǒng)absolute和相對 MRA 值與表面顏色的相關(guān)性更低 。

福斯特曼和卡森斯（1990年）同時報告了absolute有氧還原活性（ARA）和相對有氧還原活性（MRA）。奧基夫與胡德（1982年）提出，由于不同肌肉組織形成表面肌膜（MMb）的能力存在差異，相對 MRA 在預(yù)測肌肉顏色方面不如absoluteMRA 準(zhǔn)確。麥肯納等人（2005年）發(fā)現(xiàn)，當(dāng)樣本置于1%二氧化氧環(huán)境中時，部分肌肉組織會抑制表面肌膜的形成。他們通過誘導(dǎo)表面肌膜形成抵抗性（RIMF）指標(biāo)，將肌肉還原能力與顏色穩(wěn)定性相關(guān)聯(lián)。

薩梅爾等人（2002年）的研究表明，一氧化氮對MMb的還原能力可用于測定還原活性。該研究團(tuán)隊指出，由于其方法最初采用溫和氧化劑（硝酸鈉）， 相較于使用Ferricyanide的檢測方法，這種方法可能為確定MRA 值提供了更實用的解決方案。金等人（2011年）沿用薩梅爾團(tuán)隊（2002年）的方法，監(jiān)測 牛里脊肉排 在不同個體間的色澤穩(wěn)定性差異。 研究發(fā)現(xiàn)，初始肉排耗氧速率 、經(jīng)亞硝酸鹽處理后的初始MRA值以及還原后MMb含量，是評估單個肉排色澤穩(wěn)定性的關(guān)鍵指標(biāo)。

第十一節(jié) - J部分描述了一種測定完整肌肉切片中MMb還原能力的檢測方法 ，該方法改編自Watts等人（1966年）的研究。具體操作時，將樣本置于亞硝酸鈉溶液中浸泡20分鐘，使樣本表面的肌肉色素首先被氧化生成MMb。隨后將厚度為1.27厘米的切片真空包裝，在30℃環(huán)境下通過測量 K/S 反射率比值（572/525納米波長）持續(xù)監(jiān)測表面MMb濃度，持續(xù)2小時。樣本的還原能力定義為孵育期間表面MMb濃度的百分比下降值。第十一節(jié)-K部分則詳細(xì)說明了對第十一節(jié)-J部分的改進(jìn)方案，用于測定絞肉樣本的MRA值（Sammel等人，2002年）。

第XI-L節(jié)描述了肌肉勻漿中 MRA 的快速（2分鐘）測定法（Hagler等人，1979；Madhavi和Carpenter，1993年修改）。

將肌肉濾液+ NADH加入 熒光光度計比色皿中的MMb+Ferricyanide溶液中，啟動反應(yīng)。 在反應(yīng)初始線性階段（1至2分鐘）內(nèi)，通過OMb在580nm處吸光度的增加監(jiān)測MMb還元酶活性。

8. 添加底物對 MRA（乳酸、蘋果酸）的影響。 多位研究人員已對通過內(nèi)源性酶系統(tǒng)促進(jìn)MMb還原生成尼古丁酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的潛力產(chǎn)生興趣，包括生化過程可能有助于維持肉品色澤穩(wěn)定性。沃茨等人（1966）證實添加NAD可提升肉品的MRA值。當(dāng)使用琥珀酸或細(xì)胞色素c c等底物時，電子傳遞過程可將這些物質(zhì)轉(zhuǎn)化為NAD。在特定底物條件下，細(xì)胞質(zhì)中的多種脫氫1965能生成NADH。吉丁斯（1974，1977）提出線粒體或亞線粒體顆粒可參與還原肉品中的甲硫胺素（MMb），并推測線粒體通過提供關(guān)鍵還原輔因子 還原型 NADH（該物質(zhì)既可由內(nèi)源酶生成，也可通過逆轉(zhuǎn)電子傳遞過程產(chǎn)生）來實現(xiàn)這一還原作用。

最近，Kim等人（2006）和Mohan等人（2010b）證明了添加從糖酵解（乳酸）或線粒體三羧酸途徑（蘋果酸）中獲得的底物的效果。兩項研究均報告了在向 完整肌肉或骨骼肌勻漿 中添加底物后，肉類的 MRA 得到改善。

B. 熟肉研究

肉類色素（肌紅蛋白、血紅蛋白）在烹飪過程中會發(fā)生變性，導(dǎo)致球蛋白結(jié)構(gòu)解折疊。在有氧條件下，血紅素鐵極易被氧化，暴露的血紅素可能與變性蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，包括肌紅蛋白二聚體或聚集體（Tappel，1957；Ledward，1971）。這些灰褐色復(fù)合物被稱為變性球蛋白半色素，其中“半"表示血紅素鐵處于氧化狀態(tài)。盡管加熱肌紅蛋白（Mb）溶液時已采用可見光吸收光譜法，但研究熟肉色素時通常采用反射光譜法（Ledward，1971）。第XI-M節(jié)描述了一種檢測需氧烹飪?nèi)忸悾?/span>>76°C）中粉紅色變性球蛋白半色素的反射光譜方法。需注意及時進(jìn)行分析，因為這些色素在空氣中會迅速褪色（Ghorpade和Cornforth，1992；Cornforth，2001）。

1. 持續(xù)性粉紅現(xiàn)象與過早褐變——診斷方法。消費者有時會對熟肉的粉紅色感到敏感，懷疑產(chǎn)品可能未煮熟。因此，加工廠需要定期檢測產(chǎn)品以確定 并消除或減少不希望出現(xiàn)的粉紅現(xiàn)象。食材中亞硝酸鹽或硝酸鹽的污染 可能是導(dǎo)致粉紅現(xiàn)象的原因之一（希頓等人，2000年）?？赏ㄟ^霍恩西（1956年）腌肉色素檢測法進(jìn)行排查（詳見第XI-E和XI-F節(jié)）。 烤肉表面的粉紅現(xiàn)象也會因接觸燃燒廢氣中的二氧化氮而呈陽性反應(yīng)（科恩福斯 等人，1998年）。燃燒廢氣中可能含有二氧化碳，但霍恩西（1956年）方法僅能檢測NO-血紅素復(fù)合物，無法識別CO-血紅素復(fù)合物。

如果肉確實未煮熟，未變性的肌紅蛋白含量將高于正常水平。肌紅蛋白在pH>6.0時對熱變性具有抵抗力，導(dǎo)致熟肉中的肌紅蛋白濃度高于正常水平，并在內(nèi)部溫度達(dá)到80°C或更高時呈現(xiàn)紅色或粉紅色（Trout，1989；Moiseev和Cornforth，1999）。在另一個反向，Hague等人（1994）、Lavelle等人（1995）和Hunt等人。

(1999) 描述了氧化絞肉的過早褐變， 在烹飪過程中MMb變性的溫度低于OMb或DMb 。 漢堡肉的過早褐變有食品安全影響，因為肉餅可能被視為在無法殺死食物病原體的烹飪溫度下煮熟完成。

可溶性肌紅蛋白可在磷酸鹽緩沖液中提取，并如第XI - D節(jié)所述，使用分光光度計在525 nm處測量吸光度，即肌紅蛋白的等滲點。根據(jù)物種和內(nèi)部烹飪溫度，煮熟的樣品中可能殘留部分可溶性肌紅蛋白。pH值 > 6 . 0的肉類中可溶性肌紅蛋白含量會高于正常水平。另一方面，過早褐變的肉類可溶性肌紅蛋白含量低于正常水平，可能與低pH值有關(guān)。確定產(chǎn)品的pH值（第XI - B節(jié)）。

若未變性肌紅蛋白或熟肉色素導(dǎo)致的粉紅色無法確認(rèn)，則應(yīng)懷疑存在變性血紅素色素。這些粉紅色色素在罐裝或慢燉鍋烹飪等缺氧高溫條件下形成，且需在水下進(jìn)行。具體檢測方法可參照第XI-M節(jié) 。

c. 熏制肉類研究

本節(jié)闡述了檢測與定量分析熟肉及腌制肉色素及前體化合物的實驗室方法。腌制肉通常添加亞硝酸鈉或亞硝酸鉀、硝酸鹽進(jìn)行配方處理，烹飪時會生成粉紅色的腌制肉色素（單亞硝基血紅素）。天然腌制肉中，腌制劑多為芹菜籽粉或海鹽中的硝酸鹽成分。 在烹飪前 ，通過微生物發(fā)酵將硝酸鹽轉(zhuǎn)化為 亞硝酸鹽 。傳統(tǒng)火烤干肉或燒烤肉制品中，一氧化氮氣體在燃燒時會與濕潤肉表面的水分反應(yīng)生成亞硝酸根離子，從而引發(fā)烹飪過程中的表面粉

化（腌制）現(xiàn)象。

1. 腌制肉著色劑。Erdman和Watts（1957）開發(fā)了一種有效的方法，通過監(jiān)測570/650波長的表面反射率來跟蹤腌制肉顏色的變化。該測量方法可用于指示真空泄漏包裝或其他促進(jìn)顏色褪色的條件 。

經(jīng)固化處理的肉色素經(jīng)基爾德等人鑒定為單硝基血紅素。al.（1988年）通過質(zhì)譜分析證實， 硝基化血紅素的質(zhì)量增加了30，這表明結(jié)合了一個NO基團(tuán)（與先前報道的兩個不同，如此）。作為血紅素色素總量的百分比，用以衡量腌制工藝效果的 腌制肉色素含量（霍恩西，1956年）。由于血紅素色素本身是與熱使蛋白質(zhì)變性形成的復(fù)合物，因此無法直接溶解 。 但 該NO基團(tuán)可通過80%丙酮（根據(jù)樣品含水量調(diào)整濃度）萃取，并通過540納米波長的光譜分析進(jìn)行定量（詳見第XI-E和XI-F節(jié)）。

2. 總血紅素和血紅素鐵含量。 總血紅素含量可通過以下方法測定：

將所有含血紅素基團(tuán)的物質(zhì)萃取至80%酸化丙酮中，包括固化與未固化的色素，以及含血紅素的酶類和輔因子（詳見第XI-E和XI-F節(jié)）。

總血紅素含量（以血紅素計）通過A 640 法測定（Hornsey，1956）。固化過程中將血紅素色素轉(zhuǎn)化為亞硝基血紅素形式的轉(zhuǎn)化率低于80%通常被認(rèn)為是可接受的（Pearson和Tauber，1984）。在Hornsey（1956）方法中，將10g樣品混合在高燒杯中以防止過度蒸發(fā)。

皮爾遜和陶伯（1984）采用2克樣品和帶蓋試管以防止通過蒸發(fā)處理，可同時分析更多樣本。Carpenter和Clark（1995）采用5克樣本。

使用Hornsey（1956）方法進(jìn)行總血紅素測定可評估肉類中血紅素鐵含量的營養(yǎng)價值（Carpenter和Clark，1995）。 濕法灰化后肉樣中的總鐵含量可通過鐵嗪法測定（Carter，1971），其中 Fe2? 與鐵嗪結(jié)合形成紅色色素，通過562nm波長的光譜法檢測。非血紅素鐵含量可通過鐵嗪法檢測HCl-Trichloroacetic acid提取物中的鐵含量（Schricker等，1982）。不銹鋼探針型勻漿器不宜用于鹽酸 - TCA 中的樣品勻漿，因為鐵會從探針本身被提取，尤其是較舊、磨損的探針（Jayasingh，2004）。

3. 帕爾馬火腿的紅色素。帕爾馬火腿是意大利帕爾馬地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品，通過長時間腌制豬后腿制成，且不添加硝酸鹽或亞硝酸鹽類腌制鹽。莫里塔等人（1996）采用電子自旋共振光譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)，帕爾馬火腿的紅色素與亞硝酸鹽腌制肉的色素存在差異。他們進(jìn)一步證實，從帕爾馬火腿中分離出的葡萄球菌能從MMb（肌紅蛋白）衍生出紅色肌紅蛋白。若松等人（2004）通過光譜分析、熒光檢測，并運用HPLC 質(zhì)譜和電噴霧電離高分辨質(zhì)譜（ESI - HRMS）對帕爾馬火腿的鮮紅色素進(jìn)行表征。 研究發(fā)現(xiàn)，這種紅色 色素源自鋅原卟啉IX，而非含鐵血紅素色素。

 一氧化碳可使用非分散紅外分析儀進(jìn)行檢測。該儀器通過兩個獨立能量源產(chǎn)生紅外輻射。經(jīng)斬波器調(diào)制的輻射脈沖頻率為5赫茲，通過光學(xué)濾光片可有效抑制其他紅外吸收物質(zhì)的干擾。每束紅外光束均通過獨立檢測池，其中一個檢測池密封設(shè)計用于盛放標(biāo)準(zhǔn)氣體。

另一單元則持續(xù)通入樣品氣體（CO），吸收的紅外輻射量與CO濃度成正比 。

D. 包裝尺寸

由于新鮮肉和加工肉的顏色受到與血紅素結(jié)合的配體的深刻影響，而且包裝在商業(yè)上用于最小化新鮮肉和加工肉的顏色變壞，包裝在實驗室分析中需要特別考慮。以下是分析期間包裝樣品的重要考慮因素。

1. 薄膜厚度。能夠以密爾（1/100英寸；參見術(shù)語表）為單位測量厚度的數(shù)字式測微計，可用于測量薄膜和包裝托盤的厚度。許多真空包裝袋的厚度為2至3密爾，而用于新鮮零售肉類的氧氣滲透性聚氯乙烯（聚氯乙烯）薄膜覆蓋層通常厚度小于1密爾。一般來說，薄膜厚度越大，氣體滲透性越低。較厚的薄膜也更昂貴。

2. 薄膜滲透性。對于鮮肉而言，高氧滲透性薄膜可維持氧合血紅素色素（Landrock和Wallace，1955；Cornforth和Allen，2009）。極低氧滲透性薄膜（也稱為高阻隔膜）會促使脫氧血紅素色素的形成，因為肉的還原能力（Siegel，2007）。

當(dāng)氧氣分壓較低（1至25毫米汞柱）時，會加速氧化反應(yīng)并導(dǎo)致色素褐變（Kropf，2004），這種情況應(yīng)盡量避免。表10.1展示了真空度從零（真空狀態(tài)）到1個大氣壓（760毫米汞柱）時，不同真空度下大氣壓與氧氣分壓的變化 。其中特別標(biāo)注了多數(shù)快速褐變的危險區(qū)域。使用常規(guī)真空包裝機很難將氧氣含量降至該范圍以下，因此 肉類在消耗包裝內(nèi)殘留氧氣前 往往會 產(chǎn)生多聚肌肽（MMb）。相比之下，微氣泡包裝技術(shù)能通過 一次或多次向包裝腔注入目標(biāo)氣體，比真空包裝更有效地降低殘留氧氣水平。無論采用何種包裝系統(tǒng)，都需謹(jǐn)慎控制以確保氧氣分壓足夠低。

氧氣，以確保肉質(zhì)消耗殘留氧氣的能力不會被超出。

無論包裝內(nèi)真空度如何，殘留氣體的成分比例始終與空氣基本一致：氮氣78.1%、氧氣20.9%、氬氣0.9%、二氧化碳0.03%。不過，像氧氣電極這樣的傳感器檢測到的氣體濃度，其實與產(chǎn)品周圍的大氣壓成正比。舉個例子，當(dāng)真空度達(dá)到大氣壓一半時，可測得的氧氣濃度為10.45%（104,500ppm），此時氧氣分壓為79.6毫米汞柱（380/760×159.2毫米汞柱；見表10.1）。包裝膜的透氣性對抑制氧氣滲入同樣關(guān)鍵，尤其是出口產(chǎn)品這類保質(zhì)期較長的商品，更需要嚴(yán)防死守。

包裝薄膜、袋子、和托盤的氣體滲透性通常包括 水蒸氣和氧氣的滲透率。二氧化碳、一氧化碳和氮氣的滲透率數(shù)據(jù)較少。

滲透率不僅隨薄膜厚度變化，還受其他因素影響。研究報告應(yīng)包含薄膜滲透率的相關(guān)信息。

3. 改良大氣包裝技術(shù)。 高氧阻隔包裝膜可 結(jié)合多種頂空氣體，有效調(diào)控并保存肉類中的色素形態(tài)。二氧化碳因其抗菌特性在改良大氣包裝中應(yīng)用廣泛。但氮氣與二氧化碳對色素形態(tài)基本無影響，因此它們存在于改良大氣包裝頂空時不會改變?nèi)馄飞珴桑?/span>Moeller等，2004）。高氧環(huán)境有助于維持氧合血紅素色素形態(tài)（Georgala和Davidson，1970；O‘Sullivan和Kerry，2010），但需注意肉品的呼吸能力，避免氧氣消耗過量導(dǎo)致甲基甲藍(lán)（MMb）生成（Bekhit和Faustman，2005）。若包裝頂空存在一氧化碳或一氧化氮氣體，或使用含亞硝酸鈉晶體的包裝膜，會形成反映這些化合物結(jié)合的色素形態(tài)（Siegel，2007,2009）。

4. 包裝氣體成分檢測。 為驗證MAP系統(tǒng)能否達(dá)到目標(biāo)氣體成分并確保儲存期間成分穩(wěn)

定，需對包裝內(nèi)氣體成分進(jìn)行檢測報告。由于肉類呼吸作用和氣體吸收 ，MAP系統(tǒng)中的相對氣體成分在包裝保質(zhì)期內(nèi)會發(fā)生動態(tài)變化；因此，需要精準(zhǔn)確定采樣時間。通過自密封隔膜用注射器抽取包裝樣本，可借助頂空氣體分析儀測定氧氣、一氧化碳和二氧化碳濃度（Knock等人，2005；Mancini等人，2009 ；Raines和Hunt，2010）。

e. 脂質(zhì)氧化對肉品色澤（新鮮、熟成、腌制）的影響

多數(shù)肉類色澤研究都會檢測脂質(zhì)氧化指標(biāo) ， 因為肌紅蛋白氧化通常與脂質(zhì)氧化密切相關(guān) 。 脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的醛類物質(zhì)會引發(fā)肌紅蛋白構(gòu)象變化 ， 導(dǎo)致血紅素氧化加劇并產(chǎn)生褐變（Alderton等，2003）。魚類血紅蛋白在儲存過程中釋放的血紅素同樣會刺激脂質(zhì)氧化（Grunwald和Richards，2006）。類似地，加熱過程中從血紅素中釋放的離子態(tài)鐵也可能刺激脂質(zhì)氧化 ， 這可通過硫代Barbituric acid反應(yīng)物質(zhì)（TBARS）檢測法進(jìn)行測量（Igene等，1985）。

脂質(zhì)氧化程度可通過多種技術(shù)手段測定，包括揮發(fā)性氧化產(chǎn)物頂空分析（Watanabe等，2008）和感官評價，但在肉類制品中常用的是 TBARS 檢測法。TBARS檢測法基于硫代Barbituric acid與脂質(zhì)氧化醛產(chǎn)物（尤其是2,4-亞烷基二醛）反應(yīng)生成粉紅色顯色劑的原理，該顯色劑在530-535納米波長處具有MAX吸光度（Marcuse和Johansson，1973）。丙二醛（MDA）是用于 TBARS 標(biāo)準(zhǔn)曲線的化合物。該檢測法可對多個樣本進(jìn)行快速檢測，1天內(nèi)即可得出結(jié)果，且 TBARS 值與感官測試結(jié)果高度相關(guān)。

當(dāng) TBARS 值>1.0時，通常表明煮熟的肉樣存在可檢測的氧化性氣味和風(fēng)味（Greene和Cumuze，1981）。Tarladgis等人（1960）開發(fā)了廣泛使用的蒸餾法（第十一節(jié) - P）， 具體操作是將 硫代Barbituric acid（TBA）溶液加入樣品冷凝液中。為簡化蒸餾步驟，可直接將TBA溶液加入肉樣中，對未加熱樣本需等待數(shù)小時 使顯色劑形成（Witte等人，1970），或如第XI-O節(jié)所述，通過10分鐘煮沸處理（Buege和Aust，1978）。

在 TBARS 檢測中，當(dāng)存在大量脂類衍生醛類（Marcuse和Johansson，1973）及糖類（包括蔗糖，Du和Bramlage，1992）時，也會產(chǎn)生MAX吸光度為453 nm的黃色顯色劑。為消除糖類引發(fā)的黃色干擾，Du和Bramlage（1992）開發(fā)了改良方法，采用MDA和蔗糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正。另一種解決方案是采用Tarladgis等人（1960）的原始蒸餾法處理含葡萄干（含糖量70%）的肉樣，由于糖醛類化合物不揮發(fā)，不會被樣品冷凝液捕獲，從而避免了黃色顯色現(xiàn)象（Vasavada和Cornforth，2006）。

在腌制肉制品中， TBARS 值會受到殘留亞硝酸鹽的影響。為此，Zipser和Watts（1962年）改進(jìn)的 TBARS 測定法會在 蒸餾前向腌肉樣品中添加磺胺類化合物，以防止殘留亞硝酸鹽引發(fā)丙二醛亞硝化反應(yīng)導(dǎo)致的誤判 。但值得注意的是，磺胺類化合物的添加本身也會改變 TBARS 值。實驗數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)亞硝酸鹽濃度為100-200ppm時，添加磺胺類化合物的腌肉 TBARS 值始終高于未添加組。然而在0-50ppm的低濃度亞硝酸鈉條件下，磺胺類化合物的存在反而會使 TBARS 值持續(xù)降低（Shahidi等，1985年）。

F. 基礎(chǔ)研究方法

1. 肌紅蛋白的質(zhì)譜表征技術(shù)。肉品色澤穩(wěn)定性受多種內(nèi)在與外在因素影響，包括物種特異性差異、紅白肌纖維分布特征及肌紅蛋白化學(xué)特性。 質(zhì)譜分析作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)表征的關(guān)鍵工具，在肉類科學(xué)領(lǐng)域已展現(xiàn)出在肌紅蛋白功能特性研究中的巨大應(yīng)用潛力。為探究肉品色澤的物種特異性差異，Joseph等人（2010a）采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)開展研究。

采用質(zhì)譜法對野牛肌紅蛋白進(jìn)行表征；約瑟夫等人（2010a）對火雞肌紅蛋白進(jìn)行表征；蘇曼等人（2010）對鴯鹋肌紅蛋白進(jìn)行表征。

蛋白質(zhì)和肽是肌肉食品的主要成分，對烹飪過程中食品蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化至關(guān)重要。食品蛋白質(zhì)組學(xué)已開始影響食品鏈的諸多環(huán)節(jié)，包括食品生產(chǎn)、食品安全和質(zhì)量控制。近年來，質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用變換了蛋白質(zhì)特征分析、氨基酸測序以及細(xì)菌蛋白質(zhì)指紋圖譜的研究。 蛋白質(zhì)組學(xué)的新進(jìn)展為肉類科學(xué)家提供了新機遇，使他們能夠深入探究食材相互作用的分子機制，從而優(yōu)化肉類色澤及其穩(wěn)定性研究。

曼奇尼團(tuán)隊（2010年）運用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)，揭示了乳酸影響牛肉色澤穩(wěn)定性的作用機制。通過質(zhì)譜分析，科研人員能夠系統(tǒng)研究原料間的相互作用、加工過程引發(fā)的改變，并精準(zhǔn)定位食品鏈中最易出現(xiàn)質(zhì)量問題、微生物污染和營養(yǎng)流失的環(huán)節(jié)。盡管食品蛋白質(zhì)組學(xué)在肉類科學(xué)領(lǐng)域尚屬新興領(lǐng)域，但這項技術(shù)已為改善人類健康作出重要貢獻(xiàn) 。

2. 氧代謝檢測技術(shù)用于測定包裝肉中肌紅蛋白形態(tài)的相對濃度。 肉類色澤的生化因素研究已持續(xù)數(shù)十年，但鮮有研究聚焦于開發(fā)非侵入性方法 / 技術(shù)，以快速實時評估肉類整體品質(zhì)。盡管該領(lǐng)域已取得顯著進(jìn)展，現(xiàn)有表征肉色參數(shù)和預(yù)測肉色穩(wěn)定性的技術(shù) 仍存在局限性——這些方法具有侵入性、耗時費力且僅能間接反映肌紅蛋白的氧化還原狀態(tài)。類似地，用于表征組織結(jié)構(gòu)的檢測技術(shù)（如耗氧量和線粒體活性相關(guān)技術(shù)）也存在相同缺陷。肉類中光與肌肉色素的相互作用為開發(fā)近紅外（NIR）檢測肌紅蛋白氧化還原動態(tài)的方法提供了新思路。

700至1000納米技術(shù)。

近紅外光譜（NIRS）已被廣泛用于 醫(yī)學(xué)診斷和運動生理學(xué)中確定肌紅蛋白和血紅蛋白的氧吸收（Ferreira等人，2005）。 NIRS 是一種Non-Invasive、連續(xù)和快速（25至35absolute濃度的方法（Mohan等人，2010a）。

基于 NIRS 光-組織相互作用的基本方法 能實時提供關(guān)于肉類光學(xué)特性和吸收模式的寶貴信息，同時定量分析肉表面及次表層的肌紅蛋白氧化還原形態(tài)。由于 NIR 光能深入穿透如肉類等生物組織，NIRS 技術(shù)有望成為非侵入性大視場成像 死后肌肉研究的有效手段。 由于肌紅蛋白與血紅蛋白在 NIR 波段吸收波長相同， 同一方法也可用于測定 肉類肌紅蛋白的氧化還原穩(wěn)定性及其他結(jié)構(gòu)特征，這將最終幫助我們理解后處理工藝對肌紅蛋白化學(xué)性質(zhì)的影響。