一、拉曼光譜技術(shù)在細菌研究方面的主要應(yīng)用類型

       細菌存在于生活的方方面面，醫(yī)學、農(nóng)業(yè)、環(huán)境、食品、考古等多領(lǐng)域均將其作為重要研究內(nèi)容之一。拉曼光譜是一種指紋光譜技術(shù)，能夠快速獲取樣品的化學結(jié)構(gòu)信息。因此能夠被應(yīng)用于細菌分類、細菌篩選、細菌耐藥性、細菌分泌物等研究。

1、細菌分類和細菌篩選

       拉曼對細菌分類很好理解，不同細菌具有不同的細胞結(jié)構(gòu)和成分，拉曼光譜能夠區(qū)分出細菌組成的化學類型或其含量比例的不同。一般情況下，細菌的結(jié)構(gòu)很類似，肉眼難以直接判斷其類型，需要借助化學計量學對其進行分析，即可實現(xiàn)快速細菌分類。相對于傳統(tǒng)方法需要培養(yǎng)數(shù)天細菌再進行鑒別，此方法效率提高數(shù)十倍。

                     

                       Identification of bacteria in drinking water with Raman spectroscopy，Anal. Methods, 2013

                       當我們將各類細菌的拉曼光譜建立成數(shù)據(jù)庫，利用拉曼+光鑷+微流控協(xié)同體系，即可進行細菌的但單細胞篩選。

                  

                     Raman-Activated Cell Sorting Based on Dielectrophoretic Single-Cell Trap and Release.nal. Chem. 2015

                     Label-free, rapid and quantitative phenotyping of stress response in E. colivia ramanome，Scientific RepoRts ,2016

       不同細菌、相同細菌在不同發(fā)育時期，其化學結(jié)構(gòu)及其含量比例，由此可延申研究細菌生長發(fā)育分期、外部環(huán)境誘導(dǎo)細菌分化等各類研究，在此不一一贅述。

2、細菌耐藥性

       利用拉曼技術(shù)篩選有效藥物是目前（成）熟和（有）效的拉曼-細菌應(yīng)用類型。通過給細菌飼喂帶有氘原的葡萄糖營養(yǎng)液，如果細菌耐藥，則氘原子代謝到細菌細胞中，在2200cm-1處出現(xiàn)明顯的D-O峰，區(qū)別于H-O鍵，此范圍屬于俗稱的拉曼靜默區(qū)，能夠很靈敏的判別。利用這一技術(shù)，不到1小時即能夠判斷藥物對細菌是否有致死作用。

                

                  Rapid Antibiotic Susceptibility Testing of Pathogenic Bacteria Using Heavy-Water-Labeled Single-Cell Raman Spectroscopy in Clinical Samples，Anal. Chem. 2019

二、細菌研究對拉曼光譜儀設(shè)備有哪些主要要求？

       從上面的內(nèi)容得知，拉曼研究細菌具有非常好的辨識度，成熟可靠，那么是不是任何一臺拉曼都能夠用于細菌測量呢？答案是否定的。那么細菌研究對拉曼選擇有哪些核心要求呢，我們分析細菌研究的特點后即可豁然開朗。

1、細菌尺寸很小。多數(shù)細菌的尺寸在10-100微米范圍內(nèi)，部分細菌可小至2微米升值1微米以下。由此對拉曼的首要需求——小聚焦光斑。因此要求拉曼光譜儀要對激發(fā)光束進行整形、同時盡可能選擇高倍物鏡，以達到將聚焦光斑控制在細菌體積范圍內(nèi)。如下右圖為我司研發(fā)的DeepBlue系列共聚焦拉曼光譜系統(tǒng)的聚焦光斑實測圖像，100倍物鏡聚焦光斑<1微米。小的聚焦光斑還具有的另一個優(yōu)勢：即激光功率密度大，拉曼激發(fā)效率高，也保證了系統(tǒng)的靈敏度。這也就解釋了很難看到手持式或光纖探頭拉曼能夠?qū)渭毎募毦M行測試。

                 

                             左圖來自于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)請聯(lián)系作者刪除。

2、細菌多數(shù)是光學透明的。光學透明意味著拉曼的激發(fā)光很容易穿透細菌并照射到細菌的培養(yǎng)皿，則培養(yǎng)皿的拉曼信號容易干擾細菌拉曼測試。這種特點對拉曼光譜儀的Z軸的共聚焦性能也提出了更高的要求。通過減小針孔尺寸壓制聚焦光斑以外的拉曼信號，獲得高信噪比拉曼光譜數(shù)據(jù)。

3、細菌體系可能帶有熒光。細菌作為生物體會包含熒光特性的氨基酸（如色氨酸等）或其他熒光分泌物，另一方面，培養(yǎng)基材料的類別或純度也很有可能帶入熒光。因此選擇合適的激發(fā)波長也是非常關(guān)鍵的一環(huán)。如果細菌體系無熒光，優(yōu)選532nm等短波長激發(fā)，測試信號強，測試速度也快。如果確有熒光則需要選擇785nm或1064nm等長波激發(fā)，或針對研究體系選擇專門的激發(fā)波長，避開熒光干擾（如下示意圖）。

                

                     上圖為示意圖，不適合所有類型樣品，熒光特性由樣品本身決定，需要進行單獨考察

4、其他因素。拉曼系統(tǒng)的通光效率、雜散光抑制能力，光譜分辨率、探測器溫度，光譜測量范圍等因素也會影響到細菌測量。其中通光效率+雜散光抑制能力=系統(tǒng)的靈敏度更為重要，直接影響了測試結(jié)果是否可用。系統(tǒng)靈敏度另外闡述，此文暫不涉及。

三、DeepBLUE200共聚焦顯微拉曼光譜儀細菌樣品實測效果

       1、樣品來源：成都生物所

       2、樣品種類：大腸桿菌？

       3、樣品數(shù)量：2

       4、測試條件：

  注：本次測試設(shè)備部件均為國產(chǎn)，光譜儀更換為進口型號，效果更好。

       5、樣品處理辦法和測量過程:

            5.1 用鑷子將培養(yǎng)皿中的樣品挑取到中空金屬支架上，使測試區(qū)域懸空；

            5.2 白光反射照明+CCD相機+10X物鏡尋找和觀察目標細菌；

            5.3 切換至100X物鏡，聚焦清晰；

            5.2 點擊控制器，白光制動切換至激光光路，激光照射到樣品上，開始測量；

       6、測試結(jié)果

            

        以上獲得了清晰的細菌拉曼光譜數(shù)據(jù)，兩種細菌區(qū)分有明顯的拉曼峰位，達到了用戶目標要求。相對用戶此前采用本單位拉曼測試結(jié)果（如下兩圖），DeepBlue200的效果非常明顯。

                    

                      細菌1（明顯的背景信號，無細菌拉曼信號）

                       

                     細菌2（明顯的培養(yǎng)皿塑料拉曼信號，無細菌信號）

四、儀器推薦

                   

      DeepBlue200是一款高性能全自動激光共聚焦顯微拉曼成像光譜儀，用于固體液體樣品的拉曼光譜測量，用于體相材料的拉曼光譜掃描成像。特點如下：

      自動化：自動切換白光/激光光路，自動切換激發(fā)波長、自動選擇激光功率。

      高靈敏：真共焦設(shè)計，極簡光路，高雜散光抑制能力無懼硅三階峰信噪比挑戰(zhàn)，直面激光不耐受和拉曼信號弱等難測樣品的考驗，如薄膜、小顆粒和稀溶液樣品。

      穩(wěn)定性：主要力學結(jié)構(gòu)件和光機部件均采用高強度合金材料，結(jié)構(gòu)力學重心下移光學部件剛性耦合，儀器具有極（佳）的穩(wěn)定性，抗環(huán)境擾動能力強。

      靈活性：DeepBlue200可采用全國產(chǎn)光學部件，為用戶提供低成本高性能解決方案，滿足大多數(shù)用戶需求；DeepBlue200也可集成HORIBA光譜儀和XYZ掃描平臺，實現(xiàn)高光譜分辨率、高空間分辨率和大樣本自動分析等高級功能。