流式分析的應(yīng)用-細(xì)胞群比例測(cè)定
測(cè)定某細(xì)胞群體或者亞群的比例是流式細(xì)胞術(shù)最基本的應(yīng)用，完成細(xì)胞群比例測(cè)定需要解決以下兩個(gè)問(wèn)題。
問(wèn)題1：
明確總體是什么，若要測(cè)定CD4 T細(xì)胞的比例，就首先要明確這個(gè)比例是相對(duì)于哪一個(gè)總體而言的，是占所有T細(xì)胞的比例還是占所有淋巴細(xì)胞的比例，總體是根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體要求決定的；
問(wèn)題2：
明確這個(gè)細(xì)胞群體的特征表型（相對(duì)于總體細(xì)胞有什么特點(diǎn)），一般來(lái)說(shuō)就是明確這個(gè)細(xì)胞群體相對(duì)于總體內(nèi)的其他細(xì)胞具有或者缺少哪個(gè)特征性的抗原，利用該抗原的相應(yīng)熒光素偶聯(lián)抗體，就可以進(jìn)行比例測(cè)定。
操作
明確總體和細(xì)胞群體的特征表型，先將總體設(shè)門（將總體所有細(xì)胞顯示于一張流式圖中），根據(jù)細(xì)胞群的特殊表型圈出該細(xì)胞群，就可以得出比例。
| 細(xì)胞群體 | 特征表型 |
| 造血干細(xì)胞 | Lin-CD34+CD38-（人）、CD117+（小鼠） |
| 免疫細(xì)胞 | CD45+ |
| T細(xì)胞 | CD3+ |
| CD4 T細(xì)胞 | CD3+CD4+ |
| CD8 T細(xì)胞 | CD3+CD8+ |
| 初始T細(xì)胞 | CD44 low CD62L high |
| 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 | CD4+CD25+Foxp3+ |
| B細(xì)胞 | CD19+或CD20+或CD45R+ |
| NK細(xì)胞 | NK1.1+（小鼠C57BL/6系）、DX5+（小鼠）、CD56+（人） |
| NKT細(xì)胞 | CD3+ TCRβ+ |
| 單核細(xì)胞 | CD14+ |
| 巨噬細(xì)胞 | CD11b+、F4/80+（小鼠） |
| 中性粒細(xì)胞 | Gr-1+CD11b+（小鼠）、CD11b+CD15+（人） |
| 樹(shù)突狀細(xì)胞 | CD11c high MHC二型+ |
流式分析的應(yīng)用-表型測(cè)定
表型就是某種細(xì)胞表達(dá)一些重要抗原分子的情況，明確細(xì)胞表達(dá)這些抗原分子的情況就可以從一定程度上判斷這群細(xì)胞的某些特征，而且也可以從一定程度上判斷這群細(xì)胞的功能狀態(tài)。表型測(cè)定也需要解決以下兩個(gè)問(wèn)題。
問(wèn)題1：
明確測(cè)定哪個(gè)細(xì)胞群的表型，然后標(biāo)記該特征表型的熒光素偶聯(lián)抗體（或標(biāo)記其他細(xì)胞間接反映待測(cè)細(xì)胞，例3種細(xì)胞，待測(cè)細(xì)胞AB，其他細(xì)胞AC、BC等等）；
問(wèn)題2：
明確需要測(cè)定哪個(gè)或者哪些表型，然后標(biāo)記需要測(cè)定的這些表型的熒光素偶聯(lián)抗體（若表型較多，可以將樣品均分，標(biāo)記不同抗體檢測(cè)）；
操作
先根據(jù)細(xì)胞群特征表型（一般是對(duì)應(yīng)熒光素偶聯(lián)抗體所接收的通道）設(shè)門，將其顯示于一個(gè)流式圖中（流式圖中一個(gè)軸代表一個(gè)需要檢測(cè)的表型熒光信息），圈出表型陽(yáng)性的細(xì)胞或者計(jì)算平均熒光強(qiáng)度（mean fluorecence intensity，MFI），就可以得出這群細(xì)胞表達(dá)該抗原分子的情況。
大多數(shù)的表型分子都位于細(xì)胞表面，所以標(biāo)記時(shí)只需要將抗體加入到樣品細(xì)胞中即可。但有些位于細(xì)胞的內(nèi)部，應(yīng)先將細(xì)胞固定，用打孔劑在細(xì)胞膜表面開(kāi)孔后，再加入熒光素偶聯(lián)抗體，此時(shí)抗體就可以通過(guò)小孔進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部與細(xì)胞內(nèi)的抗原結(jié)合。
流式分析的應(yīng)用-細(xì)胞因子測(cè)定
細(xì)胞因子（cytokine）
是細(xì)胞合成和分泌的具有多種生物活性的低分子質(zhì)量的多肽或蛋白質(zhì)，一般在6-60kDa；
細(xì)胞因子的合成具有多源性，即不同細(xì)胞能夠合成、分泌同一種細(xì)胞因子；
細(xì)胞因子其作用具有多向性，即同種細(xì)胞因子可以作用于不同細(xì)胞，發(fā)揮不同的生理功能；
細(xì)胞因子一般以自分泌或者旁分泌的方式發(fā)揮作用；
根據(jù)功能可以分為6大類：白細(xì)胞介素（interleukin，IL）、干擾素（inferferon，IFN）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factoer，TNF）、集落刺激因子（colony stimulating factor，CSF）、趨化因子（chemokine）和生長(zhǎng)因子（growth factoer、GF）。
檢測(cè)方法
主要有三種方法：ELISA、胞內(nèi)染色法、CBA（cytometric bead array）法。
流式分析的應(yīng)用-細(xì)胞增殖檢測(cè)
流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖的方法有很多，根據(jù)待測(cè)細(xì)胞不同特征檢測(cè)方法也不同，廣泛使用的有相對(duì)計(jì)數(shù)法、示蹤染料標(biāo)記法和BrdU標(biāo)記法。
相對(duì)計(jì)數(shù)法-原理/操作
細(xì)胞增殖最直接的結(jié)果就是細(xì)胞數(shù)目的增加，如果控制樣品的體積一定，細(xì)胞數(shù)目的增加就是細(xì)胞濃度的增加，那么在相同的分析速度上樣時(shí)，濃度大的樣品單位時(shí)間內(nèi)被檢測(cè)到的細(xì)胞就越多（就是將對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組控制在相同的條件下直接上樣記錄流式細(xì)胞儀事件數(shù)，或記錄達(dá)到相同事件數(shù)的耗時(shí)，時(shí)間越短細(xì)胞濃度越大）。
相對(duì)計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞增殖不僅得到相對(duì)數(shù)值，也可以得到絕對(duì)值。如在對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組中均加入1e5標(biāo)記熒光的人工微球作為內(nèi)參，該微球大小與細(xì)胞相當(dāng)。用相對(duì)計(jì)數(shù)法同時(shí)可以計(jì)數(shù)該PE標(biāo)記的人工微球，以計(jì)數(shù)得到的數(shù)值為基值，其他對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)數(shù)值就可以根據(jù)此基值計(jì)算出各組的絕對(duì)數(shù)值。如低速上樣60s計(jì)數(shù)得到熒光標(biāo)記微球數(shù)為2000，那么相對(duì)數(shù)值2000就代表絕對(duì)值1e5，若實(shí)驗(yàn)組相對(duì)值測(cè)得5000，那么其絕對(duì)值就為2.5e5.
①對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組每種細(xì)胞所加的濃度必須相同，每組至少設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，取平均數(shù)；
②收集各組的細(xì)胞于Ep管中，注意必須將各組的所有細(xì)胞都收集起來(lái)，然后標(biāo)記需要計(jì)數(shù)細(xì)胞的熒光素偶聯(lián)抗體，4℃下孵育30min；
③PBS重懸洗去游離的抗體，再用相同體積的PBS重懸沉淀，將細(xì)胞置于上樣管中計(jì)數(shù)（上樣前可加入7-AAD排除死細(xì)胞）；
④每個(gè)樣品低速上樣90s，計(jì)數(shù)目標(biāo)細(xì)胞的數(shù)目（若加入內(nèi)參，同時(shí)計(jì)數(shù)人工微球數(shù)）。
示蹤染料標(biāo)記法-原理/操作
示蹤染料能夠與細(xì)胞發(fā)生非特異性的不可逆性的結(jié)合，結(jié)合后相當(dāng)穩(wěn)定，不會(huì)被酶類降解。
其結(jié)合主要有兩種機(jī)制：一種是能夠與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)上的氨基發(fā)生非特異性的共價(jià)結(jié)合；另一種是能夠非特異性地嵌入細(xì)胞膜的磷脂雙分子層中與細(xì)胞膜發(fā)生非共價(jià)性結(jié)合。這些染料熒光信號(hào)非常強(qiáng)烈，當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)，母細(xì)胞內(nèi)的染料會(huì)被平均分配到子細(xì)胞中，細(xì)胞的熒光信號(hào)就會(huì)減弱一半，所以通過(guò)檢測(cè)減弱的、發(fā)射示蹤染料熒光信號(hào)的細(xì)胞比例，就可以判斷細(xì)胞增殖的強(qiáng)弱。
| 染料 | 標(biāo)記機(jī)制 | 激發(fā)波長(zhǎng)/nm | 發(fā)射波長(zhǎng)/nm | 備注 |
| CFSE | 蛋白質(zhì)結(jié)合 | 488 | 525 | 常用 |
| PKH67 | 細(xì)胞膜嵌入 | 488 | 502 | 常用綠熒光膜結(jié)合染料 |
用CFSE標(biāo)記測(cè)定細(xì)胞增殖時(shí)，首先在目標(biāo)細(xì)胞增殖前用CFSE標(biāo)記，再將標(biāo)記的細(xì)胞置于增殖體系中，細(xì)胞進(jìn)行增殖時(shí)，母細(xì)胞中的CFSE會(huì)被平均分配到子細(xì)胞中，第二代子細(xì)胞CFSE濃度為原始濃度的一般，第三代只有1/4，以此類推，而CFSE的濃度與其激發(fā)后發(fā)射的熒光強(qiáng)度呈正比，所以可以通過(guò)分析增殖后細(xì)胞的熒光強(qiáng)度來(lái)計(jì)算增殖活性，熒光強(qiáng)度減弱到標(biāo)記時(shí)的1/2以及以下的細(xì)胞都是增殖后的細(xì)胞，這些比例越高，細(xì)胞增殖越活越。
①將目標(biāo)細(xì)胞濃度調(diào)整為1e6/ml，加入CFSE，標(biāo)記濃度5μmol/L。置于37℃下孵育15min，孵育過(guò)程中每隔3min左右混勻細(xì)胞一次；
②加入預(yù)冷的培養(yǎng)基終止標(biāo)記，4℃下孵育5min，之后離心；
③再用培養(yǎng)基洗滌一次，然后將目標(biāo)細(xì)胞置于增殖體系中；
④增殖結(jié)束后，上樣分析同一般樣品；
BrdU摻雜法-原理/操作
5-溴脫氧尿嘧啶核苷酸（bromodeoxyuridine,BrdU）是胸腺嘧啶核苷酸的類似物，特點(diǎn)是胸腺嘧啶環(huán)上5位C連接甲基被溴取代，在細(xì)胞增殖DNA合成時(shí)可以與內(nèi)源性的胸腺嘧啶核苷酸競(jìng)爭(zhēng)摻雜到新合成的DNA中，而B(niǎo)rdU抗體可以特異性識(shí)別BrdU，不與胸腺嘧啶核苷酸結(jié)合，所以可以用于檢測(cè)細(xì)胞增殖。
但BrdU摻雜法也有缺點(diǎn)：抗BrdU抗體分子過(guò)大，雙鏈DNA中配對(duì)的堿基對(duì)會(huì)阻礙摻入的BrdU與熒光素的抗BrdU抗體的結(jié)合，因此為了暴露BrdU的表位，促進(jìn)結(jié)合，目標(biāo)細(xì)胞常需要經(jīng)過(guò)DNA酶或者濃鹽酸等強(qiáng)變性方法處理，這會(huì)給目標(biāo)細(xì)胞帶來(lái)不小的損傷。所以BrdU摻雜法一般只適用于體內(nèi)檢測(cè)目標(biāo)細(xì)胞的增殖，例如將BrdU摻入小鼠的飲用水中或者經(jīng)腹腔注射。
流式分析的應(yīng)用-細(xì)胞凋亡檢測(cè)
目前細(xì)胞死亡的方式主要有兩種，細(xì)胞壞死（necrosis）和細(xì)胞凋亡（apoptosis）。免疫體系中主要區(qū)別：細(xì)胞壞死會(huì)釋放出內(nèi)容物，引起炎癥反應(yīng)，而細(xì)胞凋亡不會(huì)暴露內(nèi)容物，一般被吞噬細(xì)胞清除。
流式細(xì)胞術(shù)是非常重要的檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法，既可以定性也可以定量，方法有很多種，以下主要介紹常用annexin V/PI雙染色法。
Annexin V/PI 雙染色法-原理/操作
正常細(xì)胞膜的磷脂分布是不對(duì)稱的（細(xì)胞膜極性），活細(xì)胞中磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）位于細(xì)胞膜內(nèi)表面，細(xì)胞凋亡/壞死時(shí)，細(xì)胞膜發(fā)生變化，極化現(xiàn)象消失（PS均勻分布于細(xì)胞膜內(nèi)、外表面）。
Annexin V是一種對(duì)PS有高度親和力鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，可以特異性識(shí)別凋亡/壞死細(xì)胞表面的PS，而活細(xì)胞的PS位于細(xì)胞膜內(nèi)表面，無(wú)法與其結(jié)合，所以可以用偶聯(lián)FITC熒光的Annexin V鑒別死細(xì)胞和活細(xì)胞。
但是壞死細(xì)胞的PS也會(huì)從細(xì)胞膜內(nèi)表面翻轉(zhuǎn)到外表面，所以Annexin V無(wú)法區(qū)分壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞，而PI染料能夠與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，能夠區(qū)分壞死細(xì)胞和活細(xì)胞，凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞的細(xì)胞膜仍然完整，PI染料無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合，所以PI無(wú)法標(biāo)記凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞，這樣就需要兩種染料聯(lián)合使用來(lái)區(qū)分活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。
操作方法與常規(guī)標(biāo)記熒光抗體的方法一樣：加入適量的Annexin V-FITC和PI染料，4℃/常溫下孵育30min即可。
此外，用此方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，在流式圖設(shè)置象限，不能只根據(jù)對(duì)照所顯示的陰陽(yáng)性界限，而應(yīng)該根據(jù)細(xì)胞群的具體分布設(shè)置。因?yàn)樵谀承┣闆r下，如檢測(cè)貼壁細(xì)胞的凋亡時(shí)，或操作過(guò)久等等外部條件導(dǎo)致一定程度的損傷細(xì)胞膜，從而使活細(xì)胞的膜內(nèi)PS少量翻轉(zhuǎn)到膜外，導(dǎo)致活細(xì)胞的FITC-Annexin V熒光信號(hào)整體向右移，應(yīng)根據(jù)圖形向右適量移動(dòng)十字象限。
流式分析的應(yīng)用-細(xì)胞周期檢測(cè)
核酸熒光染料標(biāo)記法-原理/操作
細(xì)胞周期就是細(xì)胞分裂產(chǎn)生新細(xì)胞開(kāi)始到下一次分裂形成子細(xì)胞結(jié)束所經(jīng)歷的過(guò)程，主要分為G(0)期、G(1)期、S期、G(2)期、M期。細(xì)胞處于不同時(shí)期DNA含量不同，處于G(0)、G(1)期細(xì)胞含有二倍體量的DNA，處于S期DNA量在二倍體到四倍體之間，處于G(2)、M期細(xì)胞含有四倍體量的DNA。所以，可以利用非特異性核酸熒光染料與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，產(chǎn)生流式細(xì)胞儀可檢測(cè)到的熒光，通過(guò)區(qū)分熒光的強(qiáng)弱區(qū)分細(xì)胞處于哪一期。
| 染料名稱 | 類別 | 特點(diǎn) |
| PI（propidium iodide） | 細(xì)胞膜非通透性 | 應(yīng)用廣泛，使用前需增加細(xì)胞膜通透性并加入RNA酶降解RNA |
| 細(xì)胞膜通透性 | 標(biāo)記效果好，但需紫激光激發(fā) |
|
| Hoechst33258、33342 | 細(xì)胞膜通透性 | 活細(xì)胞標(biāo)記，但需紫激光激發(fā) |
| AO（acridine orange） | 細(xì)胞膜非通透性 | 可具體區(qū)分細(xì)胞的5個(gè)周期 |
①配制低滲檸檬酸標(biāo)記液：檸檬酸三鈉0.25g、Triton-X-100 0.75ml、PI 0.025g、RNA酶0.0005g、再用雙蒸水補(bǔ)至250ml；
②將目標(biāo)細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，取2e6細(xì)胞離心，棄上清；
③加入1ml低滲檸檬酸標(biāo)記液重懸，混勻，4℃下孵育30min；
④離心，棄上清，加入200μl PBS重懸混勻上樣分析；
去除黏連體
實(shí)際樣品中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)粘連的雙細(xì)胞或多細(xì)胞團(tuán)塊，而流式分析時(shí)可能將粘連在一起的兩個(gè)二倍體細(xì)胞當(dāng)作一個(gè)四倍體細(xì)胞，結(jié)果G(2)、M期比例會(huì)偏高，所以可以在樣品處理過(guò)程中加入少量EDTA，減少細(xì)胞之間的粘連；流式分析時(shí)，可以將目標(biāo)細(xì)胞顯示在相應(yīng)熒光通道的A（area）-W（Width）散點(diǎn)圖中區(qū)分。
流式分析的應(yīng)用-基因表達(dá)檢測(cè)
在具有活性的單細(xì)胞水平上檢測(cè)基因表達(dá)對(duì)于研究細(xì)胞的功能非常重要，能夠應(yīng)用于細(xì)胞工程系、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和功能基因組學(xué)等。流式檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)要求能夠正確指示目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄的、敏銳的、沒(méi)有毒性的熒光指示系統(tǒng)，其中常用的兩個(gè)報(bào)告基因是編碼綠色熒光蛋白的基因和編碼β-半乳糖苷酶的基因lacZ或β-內(nèi)酰胺酶/CCF2指示系統(tǒng)。
綠色熒光蛋白指示基因系統(tǒng)-原理/操作
綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是從水母Aequorea Victoria中提取的一種有內(nèi)在熒光基團(tuán)（internal fluorophore）的蛋白質(zhì)，被488nm激光激發(fā)后能夠產(chǎn)生507nm的熒光，其信號(hào)被FITC/FL1通道接收，編碼該蛋白質(zhì)的基因是常用的指示報(bào)告基因。
表達(dá)該蛋白非常簡(jiǎn)單只需要將編碼GFP的基因整合到目標(biāo)基因的啟動(dòng)子后面（pMAX-GFP、pcDNA3.1-GFP/EGFP等），當(dāng)目標(biāo)基因表達(dá)時(shí)也會(huì)同時(shí)表達(dá)GFP基因，表達(dá)后的GFP蛋白質(zhì)積存于細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)GFP的量與目標(biāo)基因的表達(dá)強(qiáng)弱成正比，檢測(cè)到的熒光信號(hào)強(qiáng)弱間接反映目標(biāo)基因的表達(dá)情況。
①構(gòu)建質(zhì)粒：在需要檢測(cè)的目的基因啟動(dòng)子之后整合GFP/EGFP片段基因；
②利用各種轉(zhuǎn)染的方式將質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，按適宜的條件培養(yǎng)細(xì)胞；
③因細(xì)胞內(nèi)含熒光指示蛋白，所以一般不需要其他熒光素標(biāo)記染色，直接收取細(xì)胞離心，棄上清并用PBS重懸上樣分析即可；
流式分析操作簡(jiǎn)單，對(duì)細(xì)胞刺激較小，但是GFP熒光信號(hào)較弱，一個(gè)細(xì)胞內(nèi)至少需要表達(dá) 50 000-100 000個(gè)GFP分子，其產(chǎn)生的熒光信號(hào)才能被檢測(cè)到（現(xiàn)構(gòu)建質(zhì)粒一般會(huì)選擇強(qiáng)熒光信號(hào)的GFP蛋白異構(gòu)體，S65T、V163A等）。因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的效率不可能達(dá)到100%，流式檢測(cè)無(wú)法區(qū)分單個(gè)細(xì)胞是否轉(zhuǎn)染成功。解決方法：在質(zhì)粒載體中再加入一個(gè)對(duì)照基因，如DsRed，表達(dá)DsRed蛋白的細(xì)胞就是轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，然后分析表達(dá)GFP的細(xì)胞占所有表達(dá)DsRed細(xì)胞的比例即為目的基因表達(dá)的比例。
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