和光純藥時(shí)報(bào) Vol.94 Number.1（2026年1月）， 地方獨(dú)立行政法人大阪府立醫(yī)院機(jī)構(gòu) 大阪羽曳野醫(yī)療中心 新一代創(chuàng)藥創(chuàng)生中心 松山晃文著

1. 前言

在日本《再生醫(yī)學(xué)安全法》的監(jiān)管下，目前已有因接受再生醫(yī)療而引發(fā)敗血癥的案例。這可能是由于未進(jìn)行適當(dāng)?shù)臉悠繁４?，且沒有做好無菌控制導(dǎo)致的。因此，本文將重點(diǎn)討論如何在藥物注射給患者之前，通過快速無菌試驗(yàn)來確?；颊甙踩Ｊ紫?，確保無菌性的關(guān)鍵在于微生物檢測(cè)，我們將根據(jù)原理對(duì)其進(jìn)行分類，并比較各種（微生物）檢測(cè)法的特點(diǎn)以及檢測(cè)范圍。然后，將討論快速無菌檢測(cè)法的選擇思路，最后闡述細(xì)胞加工制品的快速無菌檢測(cè)中未解決的技術(shù)難題。

2. 微生物檢測(cè)法的分類與應(yīng)用

細(xì)菌檢測(cè)法可分為直接依賴細(xì)胞增殖活性的增殖依賴性檢測(cè)法，和非增殖依賴性檢測(cè)法。由于非增殖依賴性檢測(cè)法可以快速獲取檢測(cè)結(jié)果，常被用作快速無菌檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)原理，可將其進(jìn)一步分為直接檢測(cè)內(nèi)源性熒光物質(zhì)的方法，以及添加熒光物質(zhì)（或可被微生物轉(zhuǎn)化為熒光物質(zhì)的基質(zhì)）的方法。

增殖依賴性檢測(cè)法是檢測(cè)增殖過程中產(chǎn)生的二氧化碳、乙酸和乙醇等小分子化合物之類的化學(xué)副產(chǎn)物的方法。

非增殖依賴性檢測(cè)法包括拉曼光譜法、檢測(cè)菌體表面散射光的米氏散射法、特異性檢測(cè)微生物DNA的核酸檢測(cè)法，以及檢測(cè)微生物特異性內(nèi)源性非熒光物質(zhì)的方法。

表1《微生物檢測(cè)方法分類》從微生物檢測(cè)方法和原理出發(fā)，整理了各類增殖依賴性和非增殖依賴性的微生物檢測(cè)法 。

表1.微生物檢測(cè)法的分類

3. 快速無菌檢測(cè)法的現(xiàn)狀

3.1 核酸擴(kuò)增法

該方法的原理是以細(xì)菌的基因序列為標(biāo)靶，進(jìn)行核酸擴(kuò)增并檢測(cè)。通常是檢測(cè)細(xì)菌DNA中細(xì)菌的的16S或23S rRNA的DNA序列（即核酸rDNA序列）。據(jù)稱，每個(gè)細(xì)菌約有100個(gè)rDNA拷貝，與比其他微生物檢測(cè)法相比，該方法在靈敏度、速度以及操作簡(jiǎn)易度上都更優(yōu)異。然而，死菌rDNA的混入會(huì)導(dǎo)致假陽性問題。由于RNA易分解，過去一直認(rèn)為rRNA檢測(cè)難以應(yīng)用，但目前已有市售的可檢測(cè)rRNA的無菌檢測(cè)產(chǎn)品（即RiboNAT™）。該產(chǎn)品降低了死菌rDNA導(dǎo)致的假陽性，操作簡(jiǎn)單的同時(shí)，還能確保檢測(cè)靈敏度和特異性。

3.2 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）

該方法的原理是，對(duì)液體中懸浮的活菌染色，并在液相中檢測(cè)。由于該方法直接對(duì)細(xì)菌數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，無需微生物增殖，因此能實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。目前常規(guī)FCM法的檢測(cè)靈敏度約為100~1,000 cfu/mL，所以若不是培養(yǎng)后的樣品則難以用于無菌檢測(cè)。如果能開發(fā)出靈敏度小于1 cfu/mL的FCM法/技術(shù)，則其在再生醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用未來可期。目前大多數(shù)FCM設(shè)備的檢測(cè)閾值都是0.5 μm，無法檢測(cè)如銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等小細(xì)菌（直徑約0.35 μm）。此外，還需注意細(xì)菌染色劑的非特異性問題。

3.3 生物發(fā)光法和熒光法

該方法不受抗生素影響，適用于全菌種，但會(huì)因?yàn)榧?xì)胞等雜質(zhì)干擾而導(dǎo)致假陽性。檢測(cè)只需數(shù)秒至數(shù)分鐘，因其主要用于檢測(cè)于氣體中的活菌，所以被廣泛用于無菌操作室的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，目前市面上還有能檢測(cè)細(xì)菌的同時(shí)鑒定菌種的儀器。環(huán)境中的細(xì)菌受低溫、營(yíng)養(yǎng)匱乏或藥物影響，大部分處于VBNC狀態(tài)（viable but non-culturable，可存活但非可培養(yǎng)狀態(tài)）。事實(shí)上，它的細(xì)菌檢出數(shù)量往往比使用培養(yǎng)基的空氣采樣法更高。由于VBNC細(xì)菌也呈陽性，所以與培養(yǎng)基法的結(jié)果缺乏一致性。

3.4 固相細(xì)胞計(jì)數(shù)法（SPC）

該方法的原理是使用過濾器捕獲液體中混雜的細(xì)菌，并通過活菌染色實(shí)現(xiàn)可視化計(jì)數(shù)。因無需培養(yǎng)，數(shù)小時(shí)即可獲得結(jié)果，這對(duì)于無法滅菌后出廠的再生醫(yī)療制品具有重要的應(yīng)用價(jià)值。該方法還可以排除增殖抑制物質(zhì)的干擾，可以實(shí)現(xiàn)菌數(shù)測(cè)定和無菌測(cè)試的快速檢測(cè)，兼具定量與定性分析能力。然而，要注意過濾器可能會(huì)堵塞，以及大部分細(xì)菌染色劑對(duì)細(xì)胞/細(xì)胞外囊泡有染色性。

3.5 氣體測(cè)定法

該方法的原理是通過檢測(cè)活菌培養(yǎng)時(shí)排放的CO₂等氣體的增加速率，實(shí)現(xiàn)細(xì)菌增殖的檢測(cè)。由于檢測(cè)需 3 天以上，因此作為快速檢測(cè)法的適用性受限。盡管操作流程簡(jiǎn)單，但當(dāng)預(yù)計(jì)樣品中存在抗生物質(zhì)時(shí)，推薦使用含抗生素吸附磁珠的反應(yīng)瓶。

3.6 薄膜過濾法（微菌落）

樣品過濾后，將濾膜放入培養(yǎng)基專用培養(yǎng)盒，培養(yǎng)后進(jìn)行染色和檢測(cè)。該方法最初為制藥用水的無菌檢測(cè)而設(shè)計(jì)，因此僅適用于需氧培養(yǎng)。將該無菌檢測(cè)法應(yīng)用于再生醫(yī)療領(lǐng)域的無菌檢測(cè)時(shí)表現(xiàn)出高靈敏度，檢測(cè)值≤10 cfu/100mL。

3.7 阻抗法

通過檢測(cè)細(xì)菌增殖過程中的阻抗（電阻）變化，檢測(cè)存活且可培養(yǎng)的微生物。由于阻抗隨樣品組成而異，需提前繪制各個(gè)樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在用于菌數(shù)檢測(cè)（定量）用時(shí)，由于需制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，操作較為繁瑣。

3.8 脂肪酸分析法

從培養(yǎng)后的菌落中提取脂質(zhì)，并使用GC-MS進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)以鑒定菌種。該方法的前處理步驟非常繁瑣，且所需受試菌量的樣本量達(dá)mg級(jí)，因此無法有效用于菌落計(jì)數(shù)和無菌檢測(cè)。

3.9 紅外吸收光譜測(cè)定法

以培養(yǎng)后的菌落作為受試樣品，使用異物分析用傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）進(jìn)行非破壞性檢測(cè)。但目前尚無用于細(xì)菌快速檢測(cè)的市售儀器。

3.10 免疫學(xué)檢測(cè)法

該方法基于熒光檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，盡管可忽略雜質(zhì)的干擾，但從定量定性的角度出發(fā)，無法應(yīng)用于菌落計(jì)數(shù)及無菌檢測(cè)。但是，該方法非常適用于從復(fù)雜菌群中檢測(cè)出特定菌種。

3.11 質(zhì)譜法

本方法以培養(yǎng)后的菌落為受試樣品，可快速完成檢測(cè)。使用胰蛋白酶處理菌落后，采用TOF-MS進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析，再通過數(shù)據(jù)庫比對(duì)鑒定菌落的菌種。該方法操作簡(jiǎn)便，且成本較低，但檢測(cè)儀器價(jià)格高昂。所以該方法難以用于無菌檢測(cè)，也基本無法實(shí)現(xiàn)細(xì)菌計(jì)數(shù)；但是若用于菌種鑒定，其可靠性較高。

4. 關(guān)于快速無菌檢測(cè)法的選擇

適當(dāng)?shù)臒o菌檢測(cè)法取決于無菌檢測(cè)的樣本種類，例如細(xì)胞種類、細(xì)胞懸液和細(xì)胞清洗液，因此檢測(cè)前需進(jìn)行討論（表2）。例如， 富血小板血漿（PRP）不僅含有血小板，還含有大量中性粒細(xì)胞。即使將細(xì)菌輸入PRP，受中性粒細(xì)胞的吞噬作用影響，菌落形成單位（CFU）也會(huì)隨時(shí)間逐漸下降。此外，由于 PRP 未經(jīng)培養(yǎng)等處理，細(xì)菌污染與增殖風(fēng)險(xiǎn)較低，尤其使用經(jīng)認(rèn)證的醫(yī)療設(shè)備采集的 PRP或許不需要無菌檢測(cè)。另一方面，有報(bào)告顯示，第三類再生醫(yī)療等提供計(jì)劃的血液來源細(xì)胞及第二類（自體）間充質(zhì)干細(xì)胞，存在因特定細(xì)胞制品引發(fā)敗血癥的病例，因此不僅需在前期討論（在日本需經(jīng)認(rèn)證再生醫(yī)療等委員會(huì)的審查）階段進(jìn)行充分評(píng)估，還必須在細(xì)胞制品輸注前確認(rèn)其無菌性。鑒于市面上已有符合技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的無菌檢測(cè)技術(shù)，可在輸注前提供無菌檢測(cè)結(jié)果，所以不進(jìn)行無菌檢測(cè)的決定在倫理上缺乏合理性。

為快速、經(jīng)濟(jì)、便捷地保障無菌性，選擇核酸擴(kuò)增法（3.1）、FCM（3.2）、生物發(fā)光法和熒光法（3.3）、固相細(xì)胞計(jì)數(shù)法（3.4）中的任意一種，或是組合上述的方法是較為現(xiàn)實(shí)地選擇。FCM與生物發(fā)光法和熒光法面臨的問題在于如何實(shí)現(xiàn)目標(biāo)和非目標(biāo)細(xì)胞（未來還將包括細(xì)胞外囊泡）與細(xì)菌的有效分離；核酸擴(kuò)增法則存在死菌rDNA等的非特異性擴(kuò)增問題。一般來說，檢測(cè)的快速性與靈敏度、特異性之間往往需要權(quán)衡，而通過組合上述技術(shù)原理，有望將快速性與靈敏度、特異性同步提升至良好水平。

此外，給藥路徑和給藥部位的選擇也非常重要，尤其是向中樞神經(jīng)系統(tǒng)或與其相連的視網(wǎng)膜給藥時(shí)確保無菌性非常關(guān)鍵。筆者期望認(rèn)證再生醫(yī)療委員會(huì)能針對(duì)此問題進(jìn)行深入探討。

5. 快速無菌檢測(cè)法使用中相關(guān)的技術(shù)問題

參考藥品GMP標(biāo)準(zhǔn)，需要抽取成品的10%~30%開展質(zhì)量檢測(cè)，并依據(jù)藥典方法確保其無菌性。盡管細(xì)胞制品難以遵循GMP要求，但在未能確保無菌性的情況下進(jìn)行給藥是違背倫理且無法接受的。因此，采用符合藥典同等要求的無菌性的快速無菌檢測(cè)法已獲得認(rèn)可。在歐洲藥典中，由于自體來源細(xì)胞制品的珍貴性，業(yè)界也在探索對(duì)最終培養(yǎng)廢液以及細(xì)胞清洗廢液進(jìn)行無菌測(cè)試。然而，這通常需要對(duì)數(shù)十毫升甚至升（L）級(jí)別的廢液樣本進(jìn)行檢測(cè)，而前文所述的各種快速檢測(cè)法往往僅適用于數(shù)百微升至 1 毫升左右的微量樣本, 這是目前的局限所在。未來，亟待開發(fā)能夠?qū)崿F(xiàn)大體積樣本濃縮，以及從樣本中高效富集回收細(xì)菌性微生物的相關(guān)技術(shù)。

6. 結(jié)語

上述各類微生物檢測(cè)法的選擇，需要根據(jù)生產(chǎn)或出貨管理的目的而定。核酸擴(kuò)增法以及生物發(fā)光法和熒光法（包括FCM）發(fā)展迅速，若能與相關(guān)設(shè)備同步開發(fā)并完成方法驗(yàn)證，這種方法會(huì)成為與固相細(xì)胞計(jì)數(shù)法以及氣體檢測(cè)法相媲美的快速微生物檢測(cè)技術(shù)。應(yīng)用合適的快速無菌檢測(cè)法，將為再生醫(yī)療提供強(qiáng)有力的安全保障。我們期望，只有經(jīng)無菌性驗(yàn)證的細(xì)胞制品方能 應(yīng)用于臨床患者。

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