Intermittent compressive force regulates human periodontal ligament cell behavior via yes-associated protein

Keywords: Cell fate decision, FTIR, Hippo signaling pathway, Human periodontal ligament cells, Intermittent compressive force, Yes-associated protein

機械調控通過機械感知和機械轉導過程影響干細胞命運分化，其關鍵在于細胞對物理和機械信號（如 ECM 硬度、外在力等）的響應。研究表明，ECM 硬度和機械力可通過影響整合素聚集、黏著斑形成、細胞骨架蛋白（如 F - 肌動蛋白）及相關信號通路（如 Rho GTP 酶），調控間充質干細胞的命運決定（如成骨分化）。而這一調控過程的具體表現，與力的模式及細胞類型相關。

牙周膜作為連接牙齒與牙槽骨的特殊結締組織，在機械力傳遞中發(fā)揮關鍵作用。研究通過多種加載模型發(fā)現，不同類型的機械力（如持續(xù)壓縮力、周期性張力等）會使人牙周膜細胞產生不同的機械生物學反應。其中，間歇性壓縮力可通過調控牙周膜細胞活性維持牙周組織穩(wěn)態(tài)，具體表現為：作為機械傳感器，通過 IL-1β 刺激 RANKL 激活骨重塑；通過 TGF-β1 信號通路促進 SOST 和 POSTN 表達，助力牙周組織重塑。  

YAP 和 TAZ 作為 Hippo 信號通路的下游介質，通過經典通路（受 Hippo 核心激酶負調控，影響細胞增殖）和非經典通路（響應機械信號，通過細胞骨架網絡調控細胞結構）參與細胞功能及組織生長調控。在牙組織中，YAP 在牙上皮和口腔間充質中表達，其異常（過表達或敲除）會影響牙齒形態(tài)發(fā)生、牙胚發(fā)育及細胞增殖，提示 YAP 在牙齒形成及牙周組織等周圍間充質組織中具有關鍵作用。YAP 在骨穩(wěn)態(tài)中具有重要作用，可通過促進成骨分化、抑制成脂分化維持骨量，例如能促進成骨細胞增殖分化、抑制骨髓間充質干細胞成脂潛能，且對人間充質干細胞的成骨與成脂分化有調控作用，在周期性強度加載下還能促進人牙周膜細胞成骨分化。但目前，關于壓縮力作用下 YAP 對人牙周膜細胞命運決定的影響仍有待研究。

基于此，朱拉隆功大學牙科學院再生牙科學zhuoyue中心及解剖學系的研究團隊探究了人牙周膜細胞是否通過 Hippo-YAP 通路響應間歇性壓縮力，并分析 YAP 敲低在此條件下對細胞增殖和命運決定的影響。研究成果發(fā)表在Heliyon期刊，題為“Intermittent compressive force regulates human periodontal ligament cell behavior via yes-associated protein"。

首先，為確定壓縮力對人牙周膜細胞中 YAP 的影響，研究人員檢測了間歇性壓縮力（ICF）和持續(xù)性壓縮力（CCF）加載后 YAP 的表達情況。結果顯示：ICF 會誘導 YAP 核轉位（圖 1B），使 YAP 活性形式增加（圖 1B）、非活性形式（p-YAP）減少（圖 1D），即ICF 可促進 YAP 的表達及活性。而 CCF 則產生相反效果，會降低 YAP 活性、 增加其非活性形式。  

圖1    壓縮力加載下人牙周膜細胞中 YAP 的表達。

為了探究牙周膜細胞是否通過 YAP 信號級聯響應ICF ，研究人員構建了 YAP 敲除（YAP-KD）的牙周膜細胞及對照細胞，施加 ICF 24 小時后檢測相關基因表達。通過蛋白質印跡法 證實 YAP 蛋白的表達受到抑制（圖 2A）。結果顯示，YAP 缺失不影響細胞活力和凋亡。ICF 處理使對照組中 YAP1 及其下游靶基因（CYCLIN-D1、C-MYC ）表達顯著上調（圖 2B、C），而 YAP-KD 組及 YAP-KD ICF 組中YAP、CYCLIN-D1、C-MYC 和 CTGF 的 mRNA 表達水平下調 ，但 YAP-KD ICF 組表達仍高于單純 YAP-KD 組。這表明 ICF 可激活 YAP 轉錄活性，且 YAP 作為機械感知蛋白能將 ICF 信號轉化為細胞變化。

圖2   ICF 加載下，YAP 敲除的牙周膜細胞中 YAP 及其下游靶基因的 mRNA 表達。

隨后，為了探究壓縮力對人牙周膜細胞增殖的影響，研究人員檢測了 ICF 和 CCF 處理后細胞增殖相關標志物的表達。結果顯示，ICF 顯著上調 LIN28a、LIN28b、OCT4、REX1、SOX2 和 KI67 等增殖相關基因的 mRNA 表達，而 CCF 無此效果（圖 3A），表明壓縮力對增殖相關基因的影響與載荷類型相關。在 ICF 條件下，YAP 敲除細胞中上述基因表達顯著降低（圖 3B），且這一結果與使用 YAP 抑制劑的情況一致。免疫熒光分析也顯示，ICF 可提高 KI67 陽性細胞比例，而 YAP 缺失會降低該比例（無論是否施加 ICF）（圖 3C、D）。

圖3    在 ICF 加載下，YAP-KD 細胞中細胞增殖相關標志物的 mRNA 表達水平。

接下來，研究人員通過體外傷口愈合實驗探究了ICF是否通過 YAP 的表達影響人牙周膜細胞的增殖。結果顯示，對照組在 48 小時后傷口幾乎閉合（圖 4A），而 YAP 敲除且經 ICF 處理的細胞傷口縮減比例低于 ICF 處理的對照組（圖 4B），經 YAP 抑制劑 DH 處理的細胞也呈現類似結果。這表明 ICF 通過 YAP 信號影響人牙周膜細胞增殖，YAP 缺失會導致其靶基因轉錄活性降低、傷口閉合延遲。  

圖4    在 ICF 加載下，YAP 沉默降低人牙周膜細胞的增殖能力。

接著，為探究 ICF 是否通過 YAP 信號影響人牙周膜細胞成骨分化，研究人員對 YAP-KD 細胞施加 ICF 24h后進行成骨分化誘導。結果顯示，YAP-KD 且經 ICF 處理的細胞中， 成骨特異性標志物OCN 和 COL1A1的mRNA 表達顯著下調（圖 5A）。ICF 誘導的細胞中 COL1 蛋白水平升高，而 YAP-KD 細胞（無論是否經 ICF 處理）中 COL1 蛋白水平均降低（圖 5B）。ALP 活性染色顯示 YAP-KD ICF 細胞成骨分化能力低于對照組。茜素紅 S 染色表明 Control ICF 組礦化骨基質分泌增加，而 YAP 抑制會顯著減少礦化物沉積（無論是否施加 ICF）（圖 5C）。

圖5    在 ICF 加載下，YAP 的抑制會阻礙人牙周膜細胞的成骨分化。

為了進一步探究了ICF是否通過 YAP 的表達影響人牙周膜細胞的成脂分化能力 ，研究人員對 YAP-KD 細胞進行成脂分化誘導。21 天后發(fā)現，YAP-KD 組和 YAP-KD ICF 組成脂特異性標志物（PPARG、ADIPOQ）的 mRNA 表達較各自對照組顯著上調，而對照組與 Control ICF 組間無顯著差異（圖 6A），表明 YAP 缺失會促進人牙周膜細胞成脂分化，而 ICF 本身對成脂分化無顯著影響。 油紅 O 染色結果顯示，在YAP-KD 細胞中含脂滴的細胞積累增多。對正常牙周膜細胞施加 ICF 可間接上調 YAP 活性，顯著減少脂滴形成（圖 6B-C）。此外，YAP-KD 組與 YAP-KD ICF 組的脂滴積累量無顯著差異，且 YAP-KD ICF 組脂滴仍多于 Control ICF 組，表明牙周膜細胞中 YAP 缺失會使其對機械力失去響應。

圖6    在 ICF 加載下，YAP 的抑制會促進人牙周膜細胞的成脂分化。

最后，為證實 YAP 是重要的機械感知信號分子，研究人員通過同步輻射 FTIR 分析檢測了細胞整體生物分子變化。結果顯示，在類似 ICF 的培養(yǎng)條件下，YAP-KD ICF 組與 Control ICF 組相比，整體生物分子結構明顯改變，脂質水平更高（圖 7A-C）。PCA 得分圖顯示兩組細胞明顯分離（圖 7D-E）。這一結果表明 YAP 是調控人牙周膜細胞成脂分化的重要信號分子。此外，對 YAP 缺失細胞施加 ICF 無法wanquan恢復對照組表型。

圖7    在 ICF 加載下，分化的  YAP-KD 細胞呈現成脂表型。

圖8   人牙周膜細胞通過 YAP 信號響應 ICF 的行為示意圖。

總之，研究表明，牙周膜細胞中的 YAP 作為機械感知蛋白調控細胞分化：間歇性壓縮力誘導 YAP 表達，促使細胞向成骨分化；而 YAP 缺失則使細胞傾向于成脂分化，這解釋了機械負荷對預防牙槽骨丟失的重要性。綜上，YAP 作為機械敏感調節(jié)因子，在人牙周膜細胞增殖及命運決定中起必要作用（圖8）。

參考文獻：Klincumhom N, Lorthongpanich C, Thumanu K, Septham P, Phomyu W, Issaragrisil S, Pavasant P. Intermittent compressive force regulates human periodontal ligament cell behavior via yes-associated protein. Heliyon. 2022 Oct 1;8(10):e10845. doi: 10.1016/j.heliyon.2022.e10845. PMID: 36247165; PMCID: PMC9561743.

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