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從分選到驗證：CytoFLEX系列護航胰腺癌免疫治療創(chuàng)新研究
然而，傳統(tǒng)識別“腫瘤反應(yīng)性T細胞”（即能精準(zhǔn)識別并攻擊癌細胞的T細胞）的方法，主要依賴復(fù)雜、耗時的“新抗原”篩選，且許多有功能的細胞在體外難以擴增，導(dǎo)致大量有效細胞被漏檢。
當(dāng)單細胞測序遇見深度學(xué)習(xí)
面對這些挑戰(zhàn)，一項由溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院等團隊聯(lián)合完成的研究，開創(chuàng)性地整合了單細胞測序與深度學(xué)習(xí)技術(shù)，繞過了傳統(tǒng)的新抗原篩選步驟，直接、快速地鑒定出胰腺癌中的腫瘤反應(yīng)性CD8+T細胞。研究還采用了TCR-T細胞殺傷類器官模型與空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)，在功能與空間層面雙重驗證了這些細胞的活性。
這種方法的核心優(yōu)勢在于大幅降低了識別腫瘤反應(yīng)性T細胞的成本與時間門檻，為開發(fā)新型T細胞療法開辟了高效的新路徑。
CytoFLEX SRT奠定高質(zhì)量數(shù)據(jù)基石
高質(zhì)量的單細胞測序數(shù)據(jù)始于精準(zhǔn)的細胞分選。研究團隊在這一關(guān)鍵步驟中選擇了CytoFLEX SRT流式細胞分選儀。在制備單細胞測序樣本時，研究人員使用PE標(biāo)記的抗人CD8抗體和DAPI對新鮮腫瘤組織制備的單細胞懸液進行染色。CytoFLEX SRT憑借其卓越的性能，將高活力的CD8陽性T淋巴細胞精準(zhǔn)分選出來，作為后續(xù)單細胞RNA和TCR測序的起始材料。
CytoFLEX SRT流式細胞分選儀確保了單細胞測序數(shù)據(jù)來源于高度純化的目標(biāo)細胞群，極大提高了后續(xù)生物信息學(xué)分析的準(zhǔn)確性和可靠性。這是構(gòu)建高質(zhì)量單細胞圖譜和深度學(xué)習(xí)訓(xùn)練集的關(guān)鍵第一步，為整個研究奠定了數(shù)據(jù)質(zhì)量基礎(chǔ)。
CytoFLEX分析儀提供關(guān)鍵功能證據(jù)
在功能驗證階段，研究團隊使用了CytoFLEX流式細胞分析儀，進行了兩項重要實驗：
在構(gòu)建TCR-T細胞時，研究使用抗小鼠TCR β鏈抗體檢測外源TCR在患者自體T細胞中的表達率，確認轉(zhuǎn)染成功。這一步驟直接證實了深度學(xué)習(xí)模型預(yù)測出的TCR能夠在T細胞上成功表達，為后續(xù)的功能驗證奠定了基礎(chǔ)。
圖2：TCR-T細胞介導(dǎo)的對腫瘤類器官的細胞毒性作用
A：明場顯微鏡圖像顯示患者來源的腫瘤類器官 (WY_04) 在不同代次 (P0, P2, P3, P5) 的生長和形態(tài)變化。B：腫瘤組織和類器官的免疫組織化學(xué)分析，顯示關(guān)鍵腫瘤標(biāo)志物的表達。C：腫瘤類器官的多重免疫熒光分析，用于檢測特定腫瘤標(biāo)志物的表達。D：流式細胞術(shù)分析顯示，轉(zhuǎn)染后第8天，患者自體外周血淋巴細胞中外源TCR基因的表達陽性率。E：與TCR-T細胞共培養(yǎng)的類器官的代表性共聚焦顯微鏡圖像，使用吖啶橙/碘化丙啶 (AO/PI) 染色以評估細胞活力和細胞毒性。Org：類器官。non-TR TCR-T control：非腫瘤反應(yīng)性TCR對照組。F：與對照組 (Org & non-TR TCR) 相比，類器官數(shù)量的統(tǒng)計結(jié)果顯示出顯著差異 (Welch's t 檢驗: ** P<0.01; *** P<0.001)。G：TCR-T細胞與類器官共培養(yǎng)的IFN-γ ELISA檢測 (Welch's t檢驗: *** P<0.001)。
研究人員用JC-1染料對持續(xù)活化的正常供者來源的T細胞進行染色，通過檢測紅色 (585 nm) 與綠色 (525 nm) 熒光信號的比例，定量分析線粒體功能狀態(tài)。分析結(jié)果顯示：持續(xù)激活超過72小時后，具有高膜電位的T細胞比例從超過70%下降到45%（圖4G）。這一在正常T細胞模型中觀察到的現(xiàn)象，為在腫瘤反應(yīng)性CD8+ T細胞中發(fā)現(xiàn)的‘線粒體呼吸鏈相關(guān)基因下調(diào)’提供了重要的間接功能證據(jù)，支持了其可能存在代謝功能障礙的推論。
圖4：人胰腺癌中TR CD8? T細胞的生物學(xué)特征
A：差異表達基因分析展示了不同亞型TR CD8? T細胞中上調(diào)與下調(diào)的基因。DEG：差異表達基因。B：沖突圖展示了不同亞型TR CD8? T細胞在指定比較組之間重疊的GO通路。C：通過GSEA分析獲得的TR CD8? T細胞相較于非TR T細胞（耗竭型和效應(yīng)記憶型）轉(zhuǎn)錄組中差異表達基因集的富集圖；p值通過單細胞GSEA的單尾置換檢驗確定。NES：標(biāo)準(zhǔn)化富集分數(shù)。D與E：韋恩圖展示了通過調(diào)節(jié)子分析，在來自四名患者（TIPC249/309、P15及P）的GZMK? Tem亞型TR CD8? T細胞中富集的FOS調(diào)節(jié)子?；鹕綀D顯示了TIPC309患者的TR CD8? T細胞中顯著上調(diào)的FOS (-) 調(diào)節(jié)子與顯著下調(diào)的FOS (+) 調(diào)節(jié)子。F：整合基因組學(xué)查看器截圖顯示了初始T細胞與活化5小時后的T細胞中線粒體位點的開放染色質(zhì)狀態(tài)?？v軸顯示了經(jīng)比對讀數(shù)歸一化后的估計片段所覆蓋的ChIP-seq范圍。G：JC-1線粒體膜電位檢測顯示了T細胞持續(xù)活化過程中不同時間點的信號強度。
該研究取得了系列重要發(fā)現(xiàn)
代謝特征：腫瘤反應(yīng)性CD8+T細胞普遍存在線粒體呼吸鏈功能受損，且受轉(zhuǎn)錄因子FOS調(diào)控。
新免疫檢查點：首次在胰腺癌中系統(tǒng)揭示了TIGIT-NECTIN2軸是腫瘤微環(huán)境中的一個重要免疫抑制通路。
TCR特性：部分腫瘤反應(yīng)性T細胞攜帶多重TCR組合，且實驗證明，組合使用多個不同的TCR比單一TCR具有更強的腫瘤殺傷能力。
預(yù)后標(biāo)志物：研究證實，腫瘤組織中腫瘤反應(yīng)性CD8+T細胞的比例越高，患者接受新輔助免疫治療的效果越好，總生存期也更長，使其成為潛在的療效預(yù)測生物標(biāo)志物。
可靠平臺，驅(qū)動前沿發(fā)現(xiàn)
這項研究完美展示了從前沿科學(xué)問題提出，到技術(shù)創(chuàng)新突破，再到嚴格實驗驗證的完整閉環(huán)。CytoFLEX SRT分選儀與CytoFLEX分析儀構(gòu)成的流式解決方案，貫穿了從“細胞精準(zhǔn)取材”到“功能深度解析”的全過程，是確保研究結(jié)論堅實可靠的核心技術(shù)支柱。
在單細胞與人工智能驅(qū)動的生物醫(yī)學(xué)研究新時代，流式細胞術(shù)作為連接“發(fā)現(xiàn)”與“驗證”的關(guān)鍵實驗平臺，其價值日益凸顯。貝克曼庫爾特生命科學(xué)的CytoFLEX系列流式平臺，以其卓越的性能與可靠性，將持續(xù)為全球科研人員在腫瘤免疫、細胞治療等前沿領(lǐng)域的探索提供強大支持。
參考文獻：
Sun, H., Shi, C., Fang, G. et al. Functional tumor-reactive CD8?+?T cells in pancreatic cancer. J Exp Clin Cancer Res 44, 253 (2025). https://doi.org/10.1186/s13046-025-03517-1
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